高纯质粒小提试剂盒(1～5mL)

本试剂盒适合提取1～5mL菌液，在碱裂解法裂解细胞的基础上，采用独特的硅基质膜吸附技术和试剂配方，通过离心吸附柱在高盐状态下高效专一的结合溶液中的质粒DNA，每个吸附柱最高可吸附30μg的质粒DNA，并最大限度的去除蛋白质、基因组、RNA和其他杂质。得到的质粒DNA可直接用于细胞转染、PCR、酶切、测序、连接等生物学实验。

试剂盒组成：

组份	200次
Buffer P1	60mL
Buffer P2	60mL
Buffer N3	80mL
Buffer PB	35mL
Buffer PW(浓缩液)	25mL
Buffer EB	30mL
RNase A(10mg/ml)	600μL
吸附柱DM及收集管	200套

储存条件：室温(15～30℃)。

自备试剂：无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项：

• 所有组分可在干燥、室温（15～30℃）环境稳定保存1年，将吸附柱置于2～8℃可保存更长时间，加入RNase A的Buffer P1置于2～8℃可稳定保存6个月。


• 第一次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混匀，置于2～8℃保存，使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。


• 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。


• 使用前若发现Buffer P2、Buffer N3、Buffer PB有沉淀，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清（请勿剧烈晃动Buffer P2）。


• 注意不要直接接触Buffer P2、Buffer N3和Buffer PB，使用后应立即盖紧盖子。


• 提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

操作步骤：

• 取1～5mL过夜培养的菌液加入离心管（自备）中，13000rpm（~16200×g）离心30秒收集菌体沉淀，尽量吸弃上清。


• 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀。
  注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。


• 向离心管中加入250μL Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4～6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液应变得清亮粘稠。
  注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。
  此步骤所用时间应不超过5分钟，避免质粒受到破坏。


• 向离心管中加入350μL Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀8～10次，充分混匀，此时应出现白色絮状沉淀。13000rpm离心5分钟。
  注意：Buffer N3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。


• 将步骤4中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱DM中，13000rpm离心30秒钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。


• 向吸附柱中加入150μL Buffer PB，13000rpm离心30秒。


• 向吸附柱中加入400μL Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。


• 将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附膜的中间部位加入50～100μL Buffer EB，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。
  注意：
  1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。
  2）质粒拷贝数较低或＞10kb时，Buffer EB在65～70℃水浴预热，可以增加提取效率。