一步法质粒小提试剂盒(0.5～5mL)

本试剂盒采用一步式细菌裂解技术，只需要一种溶液处理即可以完成细菌裂解，并且裂解物可以直接上柱纯化质粒DNA。

试剂盒特点：

• 一步式，提取一个样品只需5分钟左右，比传统的碱变性方法快捷。


• 适用于高拷贝、中拷贝和低拷贝质粒的提取。适用于各种E.coli宿主菌。


• 质粒DNA产量跟经典碱变性法相当，一般1～5mL可以得到3～15μg（对低拷贝质粒）和5～35μg（对高拷贝质粒）。


• 所得质粒DNA呈超螺旋结构的比例比碱变性法更高。


• 基因组DNA污染少。但由于操作太快，溶液中的RNase来不及降解RNA，一般会有少量RNA污染，但不影响后续实验。


• 可以直接用于电泳、酶切、PCR、细菌转化、分子克隆、测序等后续实验

试剂盒组成：

成分	规格
一步法质粒DNA提取试剂盒溶液A	70mL
离心吸附柱(宽口)	50套×2
通用洗柱液	50mL×2
DNA洗脱液2.0	10mL

保存条件：
常温运输及保存(溶液A需要4℃保存)，有效期一年。

使用方法：

• 用塑料离心管收集0.5～5mL过夜培养的饱和新鲜菌液，室温14000g离心半分钟，弃上清（培养基）。也可以使用-20℃冻存的细菌沉淀和4℃放置过夜的饱和细菌培养液，但质粒回收效率稍低。如果是中拷贝和高拷贝质粒，使用1.5mL菌液即可，如果是低拷贝质粒，最好使用3～5mL菌液。常见质粒拷贝数请参考附表。


• 在细菌沉淀中加入700μL溶液A，充分吹打或涡旋振荡半分钟。


• 将裂解液全部转移到离心吸附柱中，直接离心。如果静置3～5分钟后再离心，会提高质粒产量10%左右。


• 室温14000g离心1分钟，弃穿透液。如果使用3～5mL起始菌液，则此步的离心时间可以延长1分钟以确保所有液体成功过柱，吸附柱中没有残留液体。


• 在离心吸附柱中加入700μL的通用洗柱液，室温14000g离心半分钟，弃穿透液。


• 室温14000g离心半分钟，甩尽残留液体。
  注意：此步不能省略。


• 将离心柱置于一个自备的1.5mL塑料离心管中，在离心柱中加入30～50μL DNA洗脱液2.0(对低拷贝质粒建议用30μL洗脱，对高拷贝质粒建议用50μL洗脱)。


• 室温14000g离心半分钟，离心管底溶液即质粒DNA，可以直接用于后续实验（浓度测定、酶切、电泳和测序）或放冰箱长期保存。

本方法提取的质粒DNA有如下特点：

• 因为没有使用剧烈的碱变性步骤，所以质粒呈现天然的超螺旋结构的比例较大。


• 由于整个操作非常快速，又没有使用碱来降解RNA，所以试剂中的RNase都来不及把细菌的内源RNA彻底降解，故所得质粒比碱变性法提取的质粒有更多的RNA污染，因此不建议使用测OD的方法确定质粒DNA的浓度，故最好采用电泳比较法，即通过比较质粒DNA跟浓度已知的DNA marker的相对亮度来确定质粒的浓度。注意：RNA污染一般不影响电泳、酶切和测序。


• 如果需要进一步去除RNA污染，可以在第5步后再增加一步洗柱操作，即在离心吸附柱中加入300μL的通用洗柱液，室温14000g离心半分钟，弃穿透液，再进入下一步。


• 一般1～5mL菌液可以得到3～15μg（对低拷贝质粒）或5～35μg（对高拷贝质粒）质粒DNA。如果需要进一步提高质粒DNA产量，可以再加30～50μL DNA洗脱液2.0到离心吸附柱中再次洗脱，可以得到相当于第一次洗脱量10～20%的质粒DNA。也可以将第一次洗脱得到的质粒DNA溶液再加到离心吸附柱中洗脱，可以使质粒DNA产量提高10～20%。