霍乱弧菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

霍乱弧菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

霍乱弧菌核酸检测试剂盒（一管式 PCR-荧光探针法）
◆ 产品说明
致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于霍乱弧菌的检测。检出限为 103 CFU/ml。
◆ 产品组成（96 测试）
试剂 含量
A-VC-P 20μL × 8 管× 12 排
NG-P 100μl× 3 支
PG-VC-P 100μl× 2 支
◆ 适用仪器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600 等实时荧光 PCR 仪。
◆ 自备耗材和仪器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：模板添加区。
3）第三区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心 30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
◆ 样品处理
参照《SN/T 1022-2010 进出口食品中霍乱弧菌检验方法》中的 7.1 和 7.2 处理样品，对样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。
以无菌操作取检样 25 g，放入装有 225 mL 灭菌 APW 增菌液的均质杯内，于 8000rpm/min～10000rpm/min 均质1 min～2 min，或以剪刀充分剪碎，制成 1:10 样本匀液。深冻样品、干品、盐渍产品的初始增菌液放置在 37℃ ± 1℃
培养 6 h ± 1 h，新鲜样品的初始增菌液放置在 41.5 ℃ ± 1 ℃培养 6 h ± 1 h。如果样品不够 25g，则取全部样品，加入 9xmL 增菌液以获得 10-1 浓度的样品匀液。若上述制备的待检样品不能在当日进行培养，应放置在 2℃~8℃保存
至次日。为提高检出率，可进行第二次增菌，取 1 ml 培养物接种到 10 ml 的 APW 中，置于 41.5 ℃ ± 1 ℃培养 18 h± 1 h（加入样品前，APW 应预先保温至 37℃±1℃）。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。请于-20℃条件下保存，有效期 12 个月
◆ 实验操作
1. 模板制备（样本制备区）
建议使用试剂配套细菌组 DNA 提取系列产品，具体过程详见产品说明书。
2．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的 PCR 管，放置在室温待解冻后，离心 30 秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入 5μL 模板，顺序为 NG、待测样品模板、PG-VC-P。盖好配套的 PCR 管盖后，涡旋混匀 30s，离心 1min，立即进行 PCR 扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量 PCR 仪，荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 TAMRA。
按下列条件设置扩增反应：
PCR 循环 荧光收集位点
95℃ 3 分钟 1 个循环 —
94℃ 5 秒
40 个循环
—
60℃ 40 秒 ※
4.基线和阈值设定
基线调整取 3-15 个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。
◆ 结果判定
检测样品无 Ct 值或≥40.0，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有霍乱弧菌或含量低于检测限；
检测样品 Ct≤35.0，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有霍乱弧菌；
检测样品 35.0＜Ct＜40.0，需进行一次重复实验，若 Ct 值≥40.0 则为阴性，否则为阳性。
★ NG 反应为平滑直线，PG 反应为“S”型扩增曲线且 Ct 值＜30，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。