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- 2025年07月13日
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上海谷研
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49
产品名称：虎外周血淋巴细胞分离液试剂盒
储存条件 RT，避光，有效期2年
单位 盒
本品用于分离虎外周血淋巴细胞
本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
产品内容：
试剂Ａ 200mL
试剂D 200mL
样本稀释液（赠品） 200mL
清洗液（赠品） 200mL
保存：18℃-25℃保存，有效期两年。本品易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
操作步骤：
全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况：
情况A: 稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下：
1. 取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A 3ml、试剂D 2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。
2. 用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离 心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
3. 离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为稀释液层。第二层为透明试剂D液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂A液层。第五层为红细胞层。
4. 用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。
5. 250g，离心10min。
6. 弃上清。
7. 用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。
8. 250g，离心10min。
9. 重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。
10. 差异贴壁法纯化细胞
（1） 用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
（2） 2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
（3） 10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。
（4） 不贴壁的为淋巴细胞。
注：
a) 无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。
b) 完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
c) 由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。
情况B: 血液样本大于等于5mL时，实验方法如下：
1. 取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。
2. 将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），离心20-30min。（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。
3. 剩余步骤同“情况A”中步骤3至步骤10。
注意事项：
1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取血2h内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。血液放置超过6h后 分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2. 稀释后血液样本体积小于3ml时，试剂A和试剂D用量分别为2ml和1ml。
3. 本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面 会变成毛面，影响细胞分离效果。
4. 吸取过多的单核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
5. 吸取过多的单核细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。
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文献和实验度的功能细胞。二、人外周血中 CD4 T 细胞分选实例1.产品信息： MojoSort™ Human CD4 T Cell Isolation Kit（BioLegend, Cat#480009），阴性分选试剂盒2.检测仪器型号：BD LSRⅡ3.样本：正常人外周血4.分选前后检测相关产品：PE-CD4（Biolegend, Cat# 317410）5.实验过程（1）采血之后采用达优™ 人淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞。分离之后能见到明显的白膜层。（达优，Cat#DKW-KLSH-0100
ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。抗凝血最好及时提取PBMC，避免放置时间过长，室温下避免过夜。应选用分离效果好的淋巴细胞分离液，避免PBMC中混有过多其他细胞成分或杂质。 2． 在分离外周血淋巴细胞时，发生了溶血，会影响我的试验结果吗？ 答：外周血出现溶血后，在使用淋巴细胞分离液分离PBMC时，溶血产生的细胞碎片、血红素等杂质将极大可能悬浮
正常人外周血中的干/祖细胞的含量占有核细胞数的1%左右，经有效动员后，骨髓中的造血干细胞会释放到外周血中，使外周血中的干/祖细胞比例明显增高。动员外周血是指用有效的动员剂对供者进行动员后采集的外周血。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）是外周血动员最常用的动员剂，它可选择性的作用于粒系造血祖细胞，促进其增殖、分化，并可增加外周血中性粒细胞的数目和功能。动员外周血单个核细胞是采集经动员后的健康供者的外周血，采用密度梯度离心的方法提取其单个核细胞，其各亚型细胞的数量、细胞免疫表型、分泌
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