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- 沪震生物/HZbscience
- HZ-1071L
- 进口/国产
- 2025年07月07日
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DH10Bac Chemically Competent Cell
- 保质期：
-80℃（6个月）
- 供应商：
上海沪震实业有限公司
- 保存条件：
-80℃（6个月）
DH10Bac Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格
DH10Bac： 100μl/支
pUC19 (control vector，10pg/μl): 10μl
保存条件(保质期)： -80℃（6个月）
基因型
F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1 araD139 ∆(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsLnupG /pMON14272 / pMON7124
产品说明
DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株中含有父本杆粒 bMON14272 、辅助质粒 pMON7124 ：父本杆粒 bMON14272包含 mini-F复制子, 卡那抗性基因, attTn7 位点和 lacZα互补因子；辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区（tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid），具有四环素抗性，在细胞扩增过程中丢失，但可提高供体质粒pFastBac（具有庆大霉素抗性）转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选，DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg DNA。
操作方法
供体质粒（pFastBac等）转化重组方法：
1. DH10Bac感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入供体质粒（pFastBac等）1ng，并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入900μl不含抗生素的SOC液体培养基，37℃，225 rpm复苏4小时。
4. 复苏完成后，用SOC稀释转化液到（10-1，10-2），每个稀释用吸取100ul铺一个LB平板（共涂3个平板），平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱48h（抗生素含量较高，需在37度长时间培养才能挑到合适克隆）。
阳性验证：
1. 挑10个白色的克隆，重新划线在LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。37度过夜培养。
2. 挑选白色的克隆，转接到含有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline的LB培养液中，过夜培养。
3. 使用试剂盒（QIAGEN cat. 12162）或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。
pUC19检测转化效率方法：
1. DH10Bac感受细胞态从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养液LB，37℃，200 rpm复苏60分钟。
4. 取100μl转化液涂布到含50-100ug/ml氨苄的LB平板上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱12-16h，统计计算转化效率。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 涂板时务必涂干，平板表面不留任何水份。
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文献和实验Prior to getting cells:1) Turn on 42 deg bath. Takes about 30 min to reach 42 deg.2) Put 0.1 M sterile CaCl2 on ice.3) One tube of cells is good for several transformations.For two transformations:1) Put 10 μl of your ligation
7 的缓冲液来洗脱；洗脱液提前预热至 65℃ 也可以提高洗脱效率。 3. 提取质粒转化大肠杆菌效率低 大肠杆菌转化效率受到多种因素的影响，例如感受态细胞状态，转化方式及操作（电转或热激），质粒用量，质粒质量等等。从感受态角度优化，可以考虑感受态本身的状态，比如贮存时间、贮存方式不当会导致感受态转化效率明显降低，此外热激条件也会影响感受态转化效率，建议热激时间严格按照感受态类型或说明书操作。从质粒角度优化，可以进一步确认质粒用量，质粒浓度，质粒是否降解等。 4. 提取质粒转染细胞效率低
离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1．前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于
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