Human IL-12P70 ELISA KIT

人自然杀伤细胞刺激因子定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-12P70浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系我们。

 

IL-12P70简介：

IL-12P70也称为自然杀伤细胞刺激因子（NKSF）或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(CLMF)主要是由受激发的巨噬细胞产生的多效性细胞因子。IL-12P70还可由树突状细胞、单核细胞、郎格罕细胞、嗜中性粒细胞和角化细胞等产生。

具生物学活性的人IL-12P70是二硫键连接一个40 kDa (p40)和35 kDa (p35)的亚基的异型复合体，即70 kDa (p70)。成熟的人40 kDa (p40)亚基有13个半胱氨酸和5个可糖基化的N末端的N313个氨基酸的蛋白。无论是p40 还是 p35亚基都不具有IL－12的生物学活性，但由两个p40亚基构成的同型复合物可与IL-12P70受体结合，从而充当IL-12P70的拮抗剂。虽然小鼠的IL-12P70对人和小鼠细胞都有活性，但人的IL-12P70只对人细胞有生物活性。

IL-12P70对T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞有多种作用，这些作用包括在T细胞和NK细胞中诱导干扰素和肿瘤坏死因子的生产，提高T细胞和NK细胞毒素的活性的以及刺激T细胞和NK细胞的分化。IL-12P70是IFN-γ的强烈诱导物，但诱导出的IFN-γ反过刺激吞噬细胞产生IL-12P70和其它促炎性因子，这样，由IL-12P70诱导的IFN-γ就在感染时促炎症反应中反馈放大的机理中扮演重要的角色。IL-12P70 在通过提高Th1细胞介导的免疫反应中有重要作用。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-12P70的浓度。IL-12P70捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-12P70 会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IL-12P70 抗体后，抗人IL-12P70 抗体与IL-12P70 接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IL-12P70 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IL-12P70 浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-12P70 浓度。

 

人IL-12P70定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分	规格（96T/48T）
人IL-12P70预包被板	12条/6条
样本分析缓冲液	5ml/3ml
标准品稀释液	10ml/5ml
人IL-12P70标准品	2/1支(冻干)
人IL-12P70生物素化抗体	10ml/5ml
亲和素连接的HRP酶	10ml/5ml
浓缩洗涤液 20×	30ml/15ml
TMB底物	10ml/5ml
中止液	5ml/3ml
封板胶纸	3/2张
说明书	1份

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

 

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

 

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5x标准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释备用。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-12P70终浓度达到1000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300μl，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

 

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。      

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育60分钟。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml	典型OD值1	典型OD值2	OD平均值
0	0.0866	0.0682	0.0774
31.25	0.2046	0.1562	0.1804
62.5	0.3617	0.3203	0.341
125	0.6452	0.5734	0.6093
250	1.0872	0.9636	1.0254
500	1.59	1.5018	1.5459
1000	2.1676	2.0466	2.1071

人IL-12P70参考标准曲线

 

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

 

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为5.8pg/ml。

2.特异性：与人的G-CSF、IL-6、IL-12/IL-23 p40及小鼠IL-12 p70、IL-12/IL-23 p40无交叉反应性。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Verma, N.D. et al. (2004) SwissProt Accession #:Q9R103.

2. Hamza, T. et al. (2010) Int. J. Mol. Sci. 11:789.

3. Shortman, K. and W. Heath (2010) Immunol. Rev. 234:18.

4. Gearing, D.P. and D. Cosman (1991) Cell 66:9.

5. Khalife, J. et al. (1998) Eur. Cytokine Netw. 9:69.

6. Kang, K. et al. (1996) J. Immunol. 156:1402.