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- 2025年11月16日
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荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 绿色荧光
- 供应商：
荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 绿色荧光
- 英文名：
荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 绿色荧光
- 规格：
500T
Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于β-半乳糖苷酶的试剂盒，大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一个四聚体。β-半乳糖苷酶的每个单元包含五个区域，其中第三个是激活位点。它是细胞中一种必需酶。缺乏这种酶会导致半乳糖唾液沉积症和Morquio B综合症。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶通过LacZ操作子激活。LacZ表达的检测已经成为已经成为惯例，已经能够在每个细胞中检出少至5个复制的β-半乳糖苷酶。Amplite 荧光法β-半乳糖苷酶检测试剂盒 *绿色荧光* 使用一种荧光性半乳糖苷酶底物，它可以很敏感地的辨别LacZ+细胞和LacZ-细胞。它可以用于ELISA检测系统中，β-半乳糖苷酶的检测；也可以用于细胞表达LacZ基因的检测。这种半乳糖苷酶-断裂产物的Ex/Em = 490/520。nm，可以通过带有FITC滤光器的荧光设备检测。
适用仪器
| 荧光酶标仪 | |
| 激发： | 490nm |
| 发射： | 525nm |
| cutoff： | 515nm |
| 推荐孔板： | 黑色孔板 |
样品实验方案
简要概述
1.用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞
2.用测试化合物孵育细胞（样品）
3.裂解细胞
4.将裂解液转移至微量滴定板
5.添加FDG工作解决方案
6.根据细胞类型，在室温或37°C孵育至少5分钟
7.添加停止解决方案
8.监测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度
溶液制备
1.储备溶液
所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 FDG储备溶液（1倍）：
将125 µL DMSO（组分E）加入FDG（组分A）小瓶中，制成1X FDG储备液。 注意：25 µL FDG足以装满1个板，避光。
2.标准溶液
β-半乳糖苷酶标准品
可选（如果需要标准曲线）：用0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液制备一系列β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的稀释液。 将标准曲线上每个点的等分试样50 µL转移至平板的对照孔中。 β-半乳糖苷酶的最高推荐量为200 mU / mL（200-400 ng）。 建议对标准曲线进行2倍系列稀释，包括8个点。 注意：调整标准曲线以适合特定的实验条件，例如细胞类型，数量，转染效率和培养板的大小。 每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。
3.工作溶液
3.1 0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液：
将30 µLβ-巯基乙醇（组分F）添加到10 mL反应缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。
3.2 FDG工作方案：
将25 µL 1X FDG储备溶液加到5 mL的0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液中。 注意：请勿将FDG溶液在室温下长时间放置，否则会发生自发水解。
3.3 裂解缓冲液工作液：
使用前，将5 µLβ-巯基乙醇（组分F）加入5 mL裂解缓冲液（组分D）中。 注意：在裂解细胞之前，始终将0.1％β-巯基乙醇添加到裂解缓冲液中
样品操作及分析
表1.细胞培养板推荐的Lysis Buffer工作溶液体积
| 培养板类型 | 裂解缓冲液工作溶液（µL /孔） |
| 96孔板 | 50 |
| 24孔板 | 250 |
| 12孔板 | 500 |
| 6孔板 | 1000 |
| 60毫米板 | 2000 |
| 100毫米板 | 4000 |
1.从哺乳动物细胞制备细胞提取物
1.1用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞所需的时间。
1.2用1X PBS洗涤细胞两次。不要移动细胞。
1.3用Lysis Buffer工作溶液相应地裂解细胞。
1.3.1对于贴壁细胞：将Lysis Buffer工作溶液添加至培养板。有关建议的数量，请参见表1。
1.3.2对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取决于细胞沉淀的大小）。
1.4将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟，然后轻轻旋转平板或试管数次以确保完全裂解。
1.5继续进行FDG测定或将样品在-80°C下冷冻直至使用。注意：通过快速的冻融循环（在-20°C到-80°C冷冻1-2小时，然后在室温解冻）也可以获得良好的裂解。或者，将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶物，然后测定上清液。
2.运行ß-半乳糖苷酶测定
2.1如果需要，在室温下解冻裂解细胞管或板。如果细胞接种在96孔板上，则直接在96孔板上进行测定。
2.2在96孔板的每个孔中加入50 µL细胞提取物。如果需要标准曲线，请为标准曲线保存一些对照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，当转染效率很高时，可在裂解缓冲液工作溶液中稀释裂解液，或在转染效率低时减少裂解液的体积。如果在96孔板上进行转染，或将稳定的细胞系接种到96孔板上，请直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制，请添加50 µL非转染细胞的细胞裂解液。对于空白对照，添加50 µL 1X裂解缓冲液。
2.3向每个孔中加入50 µL FDG工作溶液。根据细胞类型，将板在室温或37°C下孵育大约5分钟至4小时。
2.4向每个孔中添加50 µL终止缓冲液（组分C）。终止缓冲液除了终止反应之外，还引起产物的荧光强度增加。
2.5用荧光酶标仪在Ex / Em = 490/525 nm处测量每个孔中溶液的荧光强度。
2.6根据线性标准曲线定量ß-半乳糖苷酶表达。
参考文献
BZLF1 Attenuates Transmission of Inflammatory Paracrine Senescence in Epstein-Barr Virus-Infected Cells by Downregulating Tumor Necrosis Factor Alpha
Authors: Xubing Long, Yuqing Li, Mengtian Yang, Lu Huang, Weijie Gong, Ersheng Kuang
Journal: Journal of Virology (2016): 7880--7893
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文献和实验一、 GFP背景概述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由Osamu Shimomura于1962年在水母（Aequorea victoria）（图2a）中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用（图3）。在Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短
joo 如题，要做衰老，没有决定定哪家的SA-bata-gal的检测试剂，请教大家都用什么呀？另外看到碧云天很便宜，谁用过他家这个产品吗？ joo 求助！ joo 自己顶！ zmz_1 I am using this in Boston, works very well. check the data sheet. applied
dmdfe 本人将GFP基因后面加了一段大约110bp的序列，插入PET28A的BamH1和Hind3位点，最后在BL21中表达。 经SDS-PAGE验证表明： 目的蛋白 大量存在菌体裂解后沉淀即包涵体中，但是该沉淀无色。 少量存在于上清中，上清显微弱的绿色。 看文献大量报道GFP融合蛋白几乎都形成可溶性表达，目的蛋白在上清中，并且诱导条件没有太大要求。 想请教一下各位做过GFP原核表达的经验
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