Y187酵母感受态细胞

Y187酵母感受态细胞
Y187 Chemically Competent Cell

产品货号： JLC-G043                

保存条件： -80℃   

产品规格 :  10×100μl 50×100μl

产品介绍 :  
 
基因型 :  

MATα, ura3-52, his3-200, ade 2-101,  trp 1-901, leu 2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1

简单说明 : 

Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株（Y2HGold，AH109等）通过mating操作进行筛库试验。Transformation  marker为: trp1, leu2，报告基因为：lacZ, MEL1。Y187 -GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。

质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1 ~ 174位氨基酸区段的DNA结合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。

正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y187有两个报告基因：lacZ, MEL1，分别由两种不同的启动子（G1，M1）启动，这两种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。 High5TM系列Y187感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA 。

操作说明 : 

1. 取100 µl冰上融化的Y187酵母感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5 min,快速冰浴，重复一次) 10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。 

2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。 

3. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。 

4. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。 

Preparation of Media：
YPDA （1L）:
Tryptone                                      20g
yeast extract                                10g 
0.2% adenine                               15ml
补水到 950ml，  用盐酸调PH到      6.5
Agar                  20g (for plates only)
121度，15分钟高压灭菌，待培养基温度降到55度时，加入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g补水到1L，溶解后高压灭菌或0.22um滤膜过滤除菌

注意事项 : 

1. 感受态细胞在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. Y187酵母感受态细胞酵母菌株对高温敏感，适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。