RNAtrip （总RNA提取试剂）

描述：RNAtrip成功避开各种商业RNA提取试剂盒的种种弊端，采用新技术和工艺，在提取过程中既能有效裂解组织细胞，强烈抑制RNA酶活性，保护RNA免受降解，同时也能极为有效地分离去除DNA和蛋白质。RNAtrip使RNA分离如同提取质粒DNA一样简单可靠，可在30-60分钟内完成，获得极高纯度的总RNA沉淀，可用于RT-PCR、Northern Blot、RNA酶保护、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译等实验。

储存: 4°C密封避光保存两年以上有效。因疏忽或冰箱意外停电，RNAtrip密封避光存放于25°C室温数个月，品质不受影响。

适用:
(1) 固体组织 (100 mg /ml ): 人、动物、植物的各种新鲜或冻存组织。
(2) 培养细胞 (5~10× 106细胞/ml): 真核细胞，细菌、酵母。
(3) 液体标本(100 µl/ml): 全血、体液、尿液，病毒样品等。

用户实验用品和操作准备:
极微量的RNA酶都会导致RNA降解。分离RNA时，RNA酶污染主要来自以下五个方面：(1) 来自实验人员的双手。(2) 来自器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源RNA酶。(4) RNA未能完全与蛋白质分离。(5) RNA沉淀和溶解时来自吸头离心管和溶液。我们的Step by Step质量监测表明，RNAtrip可100％抑制RNA酶活性并在分离步骤完全清除RNA酶。因此在有RNAtrip存在的步骤中，使用高压消毒20分钟的吸头离心管和溶液即可胜任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后，来自实验材料的RNA酶污染将会导致RNA降解，应严格使用高压灭活RNA酶的用品。戴手套无疑是有益的，但戴口罩和帽子则无必要。只要严格按照本指南进行准备和操作，使用RNAtrip总是能获得高纯度RNA。

1. 固体组织破碎设备。准备下列装置之一，1)玻璃匀浆器。必要时泡酸清洁，用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。2)研钵。适用于液氮冻存组织的研磨，清洗方法同玻璃匀浆器。3)组织细胞超声破碎仪器。探头插入装满蒸馏水的试管或烧杯中，开启超声清洗探头30秒至1分钟。4)高速机械匀浆器(Polytron，Tekmar或类似产品)。打开开关，在蒸馏水中清洗分散器头数次。对这些装置的部分部件高压消毒30分钟是保险的措施，但使用RNAtrip这种处理并不必要。
2. 高压蒸汽30分钟消毒一次性吸头离心管。RNA沉淀和溶解之后，应严格使用高压消毒的一次性用品。然而RNAtrip能在RNA酶污染环境下工作，在裂解步骤可使用未高压但洁净的一次性吸头和离心管，但仅推荐在紧急情况下这样做。比如由于不可预测的原因，动物已经处死，组织已取出，细胞已收取，而吸头和离心管尚未高压处理。这仅仅适用于RNAtrip试剂，对其它来源RNA提取试剂无效。此时保险做法是使用普利莱基因技术公司的另一种产品――组织RNA保护液(Cat# R1030)，用户可把来不及处理的标本保存在RNA保护液中，37°C保存3天，25°C保存2周，4°C保存4周，－20°C保存数月，固体或液体标本中RNA不会降解。
3. DEPC处理的双蒸水。加DEPC到水中至终浓度为0.01% v/v，室温过夜，高压消毒30分钟。用于溶解RNA，配制TE缓冲液和75％乙醇。
4. 普通双蒸水，高压消毒30分钟，用于冲洗器皿，配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。注意溶液配制后高压灭菌，但琼脂糖不能高压处理。
5. 异丙醇，氯仿，纯乙醇，分析纯。75%乙醇用高压消毒蒸馏水配制。
6. 其他用品：电泳槽，双蒸水冲洗。离心机和加样器，无需处理。
7. 冰盒和湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA降解。
8. 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA使用大量RNA酶，为防污染须特别清洗实验器具和实验区域。

RNA提取程序
1. 组织细胞破碎与裂解
冰上操作。立即并快速破碎组织至关重要。组织细胞过量不仅使RNA得率下降，还将导致DNA和蛋白质污染。在紧急情况下，如动物已处死，组织已取出，细胞已收取，异地取送标本，用户尚未做好实验准备时，推荐用户把组织细胞储存在RNA保护液(Cat# R1020)中，保证标本中的RNA不被降解。

(1) 固体组织。按比例每50-100 mg组织加1 ml RNAtrip试剂。用研钵研磨(仅适用于液氮冻存组织)：组织放在研钵中研成粉末，加1 ml RNAtrip试剂，继续研磨至组织完全裂解。用玻璃匀浆器匀浆：加入RNAtrip上下手动匀浆组织10-15次。用高速机械匀浆器：将组织放入塑料试管内，试管置冰浴烧杯中，加入RNAtrip试剂，将分散器头垂直插入管内与组织块接触，转速12,000-20,000 rpm，上下移动试管10-20次，直到组织完全打散，无肉眼可见大块。用超声仪：需根据机器型号进行预试验，选取有效破碎组织的功率和时间。
注意：(1)通常用50-100 mg组织可获得足量的RNA，对绝大多数实验目的绰绰有余。加入过量组织或过少RNAtrip容易导致提取失败。(2)少量难以打碎的组织碎片不影响后续RNA提取。(3)用研钵和玻璃匀浆器匀浆破碎组织时，应略微多加一些裂解液，以补充裂解产物粘在容器壁上造成的体积丢失。

(2) 培养细胞。贴壁细胞：弃培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞一次。每5-10106个细胞加1 ml RNAtrip试剂，但RNAtrip加入量必须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。一个75 cm2瓶皿的细胞通常需要2 ml提取液，一个35 cm2瓶皿的细胞需要 1 ml提取液，更小的培养瓶皿可使用更少的提取液，但后续操作会因体积过小而极为不便。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上5分钟，倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。悬浮细胞：低速离心收集细胞，将细胞快速重悬于50-100l的PBS或去离子水中，每5-10106细胞加1 ml RNAtrip裂解。注意直接裂解未重悬的细胞沉淀，裂解物将十分粘稠而难以分散。细菌酵母：离心收集沉淀，加入50-100l去离子水重悬细胞。每107细胞加入1-2 ml RNAtrip直接裂解。某些细菌和酵母细胞可能需要匀浆破碎。

(3) 液体标本：如体液、尿液、全血。每100l液体样品加1 ml RNAtrip，置冰上1-3分钟。未抗凝的凝固血液按固体组织处理。RNAtrip Liq (Cat# R1020)产品专门用于液体标本RNA提取。

2. 将组织细胞裂解物转移到1.5 ml离心管，置冰上10分钟。优化步骤：如果组织裂解物含较多的碎片，或提取植物组织，12,000g 4°C 离心10 分钟，取上层裂解液，弃管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪组织，12,000g 4°C 离心10 分钟，小心吸掉最上面的油层，弃去。再取裂解液，弃管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如带少量油滴不影响提取。

3.  加入0.2体积的氯仿(0.2ml)，充分颠倒混匀，冰浴5 分钟，溶液分相。有时分相不明显，不影响提取。

4. 12,000  g 4°C离心10分钟，溶液分为两相。RNA在上层水相，下层为有机相，两相界面是一层薄膜其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出0.5ml上层水相转移到新离心管。注意：取上清液时应保留0.5-1 mm厚的水相，以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入，应将所取的上清液放回管中并重新离心10分钟，再次吸取水相。这一点至关重要，违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。如需同时提取DNA或蛋白质，则保留中间相和下层有机相，向公司索要操作方法。

5. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于上清液充分混匀。冰上孵育10 分钟沉淀RNA。用更低的温度和更长的时间进行沉淀并不必要。如果起始组织细胞的量很少，－20°C放置一至数小时可沉淀几乎所有的RNA。
注意：从富含多糖的植物组织或富含糖原的动物肝脏组织提取RNA时，按以下步骤进行：以每1 ml RNAtrip裂解组织，加氯仿后离心得到约0.5 ml上清液计算，分别加入上清液一半体积即0.25 ml 的高盐溶液(0.8 M 柠檬酸钠和1.2 M NaCl)和0.25 ml异丙醇，混匀。执行下面的离心沉淀步骤6。离心后可有效沉淀RNA，但多糖或糖原存留在上清可被弃去。从富含多糖的植物和动物肝脏组织提取RNA时，推荐使用植物RNA分离试剂Plant RNAtrip或Plant RNA Extraction Kit。

6. 12,000  g，4°C 离心10分钟。管底可见少许RNA沉淀。注意：如初始组织细胞量少，RNA将附着在管壁，用肉眼几乎难辨沉淀，但不影响实验。如RNA 沉淀量很多并呈胶冻状，通常表明有蛋白污染。应仔细检查操作步骤。

7. 弃上清。立即加入1 ml 用DEPC水配制的75%乙醇，颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000  g离心5分钟。弃上清，尽量完全吸去管壁上的液体。注意：乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在4°C保存一周或在－20°C保存一年。

8. 敞开管口空气干燥5-10分钟使残留液体挥发，略微干燥RNA沉淀即可。用50-100 l自备的DEPC处理的高压消毒纯水或TE溶解沉淀。RNA溶液可保存于－70°C或液氮中。注意：过分干燥将使RNA难以溶解。55°C加热或反复冻融数次可以助溶。RNA溶液加3倍体积乙醇冻存于－20°C，用时离心沉淀。

说明
1. 每100 mg组织RNA预期得率为：肝脾60-100 g, 肾50 g, 脑组织10-15 g, 胎盘20-40 g, 脂肪50 g。1 x 107个细胞通常得50-100 g。
1. 测定OD值，根据OD260计算RNA浓度。OD260/280比值可初步判断RNA质量，比值在1.6-2.0之间均属正常。起始组织量过大，或吸取了有机相或碎片，将使RNA样品中蛋白和杂质含量高，RNA沉淀乙醇洗涤不充分(步骤7)，均可导致OD260/280比值降低。但切记OD260/280比值还受很多非质量因素的影响。例如，RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，用TE或离子强度较高的溶液溶解时较高，但均不影响RNA后续使用。切记即便是已降解的RNA，OD260/280比值也能达到看似完美的2.0左右，因此该比值并非判断RNA降解与否最佳的指标。判断RNA质量的最佳途径是进行普通RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性。
2. 检查RNA完整性。取1 g RNA样品进行1%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，紫外灯观察。28S RNA~5 kb亮度应该约为18S RNA~2 kb的两倍，有时可见0.1-0.3 kb 的5S RNA。
3. 调整RNA溶液的体积或重沉淀RNA。（1）加入适量DEPC处理过的高压消毒纯水或TE缓冲液，于RNA溶液中，使溶液体积补齐到约400 l；（2）加入 0.1 体积的3M 醋酸钠 pH 5.2，混匀；（3）加入2.5体积的纯乙醇，混匀；（4）冰上孵育10 分钟；（5） 执行上述RNA提取程序的步骤6－8。
4. RNAtrip勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤，立即用大量水清洗。