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攸碧艾(上海)贸易有限公司
服务介绍
分子克隆和质粒载体构建
分子克隆是指在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。
载体构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。为把DNA分子运送到受体细胞中去,必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒(plasmid),在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。
本公司拥有一支经验丰富,优秀刻苦的分子生物学队伍。可以根据您的实验要求为您完成分子克隆和载体构建及改造的任务。
服务内容
1.以PCR为基础的各类载体构建,如细菌表达载体,酵母表达载体,哺乳动物表达载体,穿梭质粒等;
2.基因突变,包括定点突变,多点突变,基因缺失等;
3.载体改造;
4.siRNA载体和miRNA表达载体的构建。
服务说明
1.顾客提供:
1)含有目的片段的质粒,含质粒的甘油菌一份
2)引物序列、载体图谱一份、测序结果一份
3)载体构建操作说明一份(包含所需的试剂和耗材,仪器设备,试验流程及标准化Protocol)
2.注意事项:
1) 客户提供载体构建及改造的具体实验方案,目的基因产物及序列,载体的详细背景资料(本公司载体库中没有的)。
2) 客户只提供组织、细胞等样本,还需提供目的基因NCBI登录号,本公司额外收取RNA提取及逆转率费用。
3)表达载体,病毒载体的构建,需要提供序列的资料及目的克隆位置。
4)本公司已有的载体和模板,免费提供。
3. 实验周期:1个月。
4. 若另有疑问欢迎向本公司咨询,我们将竭诚为您服务。
质量承诺
1.有效的质粒;
2.真实的原始实验数据;
3.详细的实验步骤;
4.权威可靠的实验报告。
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文献和实验体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长,并不发生裂解,但生长速度则较正常菌慢,取感染M13的细菌培养液离心,即可从菌体中提取RF DNA ,供限制酶切割等分子克隆 操作之用;从离心后的上清液中,可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌体颗粒,提取单链DNA (ss DNA )供DNA 序列分析,体外定位突变等使用。 (二)噬粒(phagemid)在质粒DNA 中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA ,即构成了噬粒,如pGEM-3Zf(-)就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作,但当需要制备
重组插入目的片段,启动子,终止子等是构建完整表达框时所需要的元件,标签序列等可以用于表达鉴定等实验。在质粒载体设计及构建工作中,根据实验的需求情况可以增减质粒载体上的具体元件,以及插入实验需要的相关基因。 2、质粒载体构建的常规流程 通常质粒载体构建的操作需要经过下图所示流程。其中目标序列确定需要根据实验需求以及查阅生物信息数据库的相关序列来确定。目标序列 PCR 扩增则根据实验需求以基因组 DNA 或者反转录得到的 cDNA 为模板,经过高保真 PCR 实验扩增得到相关目的片段。质粒载体确定由实验
说明都显示单片段插克隆效率> 95%——片段越多效率会下降的)。市售产品中,是否包含感受态细胞,是否包含质粒纯化试剂或者 PCR 纯化试剂,都会影响产品单价。 后继的筛选验证工作同经典方法一样——抗性筛选,挑克隆扩增纯化,电泳+酶切或者 PCR 验证,最后挑几个最有可能的克隆去测序验证。如今分子克隆中的 PCR 一般都会选择高保真酶——出错率比 Taq 低得多、扩增长片段效果更好,要是几十 kb 还得是 EX 加长版高保真酶——相比后继测序验证的费用,这钱万万省不得的。 总而言之,基于同源序列的无缝
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