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- 百奥莱博
- BTN14-42600-JLD
- 北京
- 2025年07月13日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
421
- 英文名：
Actinobacillus pleuropneumoniae qPCR Kit(Dye Method)
- 保质期：
长期
- 供应商：
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50次
特别提示：包括胸膜肺炎放线杆菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
产品名称：胸膜肺炎放线杆菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)
英文名称：Actinobacillus pleuropneumoniae qPCR Kit(Dye Method)
产品货号：BTN14-42600
产品规格：50次
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)是一种呼吸道寄生菌，主要存在于患病动物的肺部和扁桃体，病猪和带菌猪是本病的主要传染源。本病的感染途径是呼吸道，即通过咳嗽、喷嚏喷出的分泌物和渗出物而传播，而接触传播可能是其主要的传播途径。国内外的研究及临床实践表明，猪患呼吸系统疾病时，容易发生继发感染或混合感染。如本病与猪伪狂犬、兰耳病、多杀性巴氏杆菌、肺炎霉形体、嗜血杆菌等病原的混合感染，应引起高度重视，因此快速检测胸膜肺炎放线杆菌具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测胸膜肺炎放线杆菌的试剂盒。
试剂盒特点：
1．即开即用，用户只需要提供DNA模板。
2．特异性高，引物是根据人胸膜肺炎放线杆菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。
3．引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR高100倍。
4．提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。
5．一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染。
6．本产品只能用于科研，本试剂盒足够50次20μL体系的PCR。
试剂盒组成：
| 组分 | 规格 |
| 2×qPCR MagicMix | 0.5mL（棕色） |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1 mL（亮黄盖） |
| 胸膜肺炎放线杆菌PCR引物混合液 | 100 μL（白盖） |
| 胸膜肺炎放线杆菌PCR阳性对照 (1×108拷贝/μL) |
50 μL（红盖） |
| 核酸释放剂试用装 | 20次（1mL，绿盖） |
有效期：-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：DNA模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法：
一、制备标准曲线样品（以102-107拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1．标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2．用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3．在7号管中加入5 μL阳性对照（其浓度为1×108拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×107拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4．换枪头，在6号管中加入5 μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5．换枪头，在5号管中加入5 μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6．重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7．用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8．如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的天净沙核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。
三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9．如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做（可以选4号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。
10．在标记管中按下表加入各成分：
| 成分 | N+2个样品管 | PCR阴性对照管 | 标准曲线样品管 （2-7管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
| 胸膜肺炎放线杆菌PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
| 自备10×ROX(见注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
| N+2个待测样品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
| 自备超纯水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
| 第7步所得标准曲线 样品稀释液（2-7号） |
不加 | 不加 | 各6μL （2号样到2号管， 3号样到3号管…） |
注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。
11．盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。
四、荧光定量PCR反应参数
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 94℃ | 5min |
| PCR反应（40个循环） | 94℃ | 30s |
| 50℃ | 30s（采集SYBR通道的荧光信号） | |
| 72℃ | 30s | |
| 最后延伸 | 72℃ | 10min |
五、数据处理
12．设12.定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。
13．如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
14．如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
我公司销售的胸膜肺炎放线杆菌荧光定量PCR试剂盒(染料法)，质量上佳，价格普惠，欢迎广大新老客户踊跃订购。
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文献和实验光染料可以作为你初步的选择对象。老实说，荧光染料法实质上无非就是常规的PCR反应中添加了荧光染料，借助染料和双链DNA的结合所发出的荧光实时监控反应的进程。由于不需要设计序列特异性探针和优化反应条件，价格低廉，通用性强，而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量PCR仪，因而同样得到广泛采用。荧光染料法的专一性和PCR没有本质的区别---但是作为“失之毫厘，谬之千里”高度精确的实验，你依然可以选择更好的荧光染料、更严谨专一的PCR酶、更好的缓冲体系来提高反应的可靠程度。 在荧光染料法的定量PCR反应试剂中
双球菌NG，巨细胞病毒CMV，结核分支杆菌Mtb、禽流感、阪崎肠杆菌、口蹄疫、新城疫、猪瘟、大肠埃希菌O157∶H7、沙门菌、炭疽芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等。 PCR仪的应用范围广，几乎所有的生命科学领域都要涉及：食品检测、临床检验、疾病控制、检验检疫、科研实验室、食品安全、化妆品检测、环境卫生等。国内多家试剂厂商生产了包括肝炎、性病、优生优育、呼吸道疾病、禽流感、阪崎肠杆菌、口蹄疫、新城疫、猪瘟、大肠埃希菌O157∶H7、沙门菌、炭疽芽孢杆菌、胸膜肺炎放线杆菌
了我的扩增曲线呢？ 其实，这种现象并不是偶发的，有很多原因可能导致，并且有个专属名称「Hook Effect」，翻译过来叫「鱼钩效应」。「鱼钩效应」指在荧光定量 PCR 过程中，DNA 扩增到指数增长期后出现的一种荧光信号不能保持稳定（或者上升）而出现下降的现象 [1]。 导致扩增曲线出现这一现象的因素比较复杂，这里我们分别从嵌入性染料法与探针法两种定量方式的角度为大家解释： 嵌入性染料法： 嵌入性染料法（例如 SYBR Green I）产生「鱼钩效应」主要是由于模板序列混杂，在 PCR
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