日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)

日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)
【产品名称】
商品名称：日本乙型脑炎病毒（JEV）核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)
Name  ：Japanese Encephalitis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
【预期用途】
日本乙型脑炎，又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）引起的一种人畜共患传染病。JEV主要是通过带病毒的蚊虫叮咬传播，而猪是JEV的主要增殖宿主和扩散宿主。JEV可引起妊娠母猪发生流产和死胎、公猪发生睾丸炎，新生仔猪发生脑炎、育肥猪持续高热，对养殖户造成巨大的经济损失。日本乙型脑炎广泛存在于世界许多国家，严重威胁着人类的健康。
本试剂盒适用于检测的脑海马回部组织、全血等标本中日本乙型脑炎病毒RNA，适用于日本乙型脑炎病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。
【检验原理】
本试剂盒用一对日本乙型脑炎病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光RT-PCR技术对日本乙型脑炎病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
【试剂组成】

名      称	规      格
酶液	50μL×1管
JEV反应液	500ul×2管
JEV阳性质控品 1.69×10^8拷贝/ml	50μL×1管
阴性质控品	250μL×1管

注：
1.不同批号试剂不能混用。
2.试剂盒内各试剂组分足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过5次，有效期12个月。

【适用仪器】
ABI 、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。

【标本采集】
病死或扑杀动物的脑海马回部组织2g；待检活动物，抽取全血5ml

【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】
1.样品处理（样本处理区）

1. 样本前处理

每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100ul于1.5ml灭菌离心管中；全血样品待血凝后取血清100ul于1.5ml灭菌离心管中。

1. RNA提取

推荐采用上海晅科生物科技有限公司生产的RNA提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。
2.试剂配制（试剂准备区）根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	JEV反应液	酶液
用量	20μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到PCR反应管中，21uL/管。
3.加样（样本处理区）将步骤1提取的RNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR扩增（核酸扩增区）

1. 将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；
2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；荧光通道选择：

检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光，选择None即可。

5.推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	42℃	20min	否
2	1 cycle	95℃	10min	否
3	40 cycles	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

6.结果分析判定
结果分析条件设定设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
结果判断
阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道35 阴性：样本检测结果Ct值>38或无Ct值。

质控标准阴性质控品：Ct>38或无Ct值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤32；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
【注意事项】

• 所有操作严格按照说明书进行；
• 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
• 反应液应避光保存；
• 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
• 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
• 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
• 实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
• 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。