使用说明:
根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE 分离胶配制浓度,凝胶浓度配方参考附表。
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分离胶 |
夹层胶 |
浓缩胶 |
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16.5%/4.5ml |
15%/4.5ml |
10%/1.8ml |
4%/2ml |
49.5%Acr |
1.50ml |
1.36ml |
0.36ml |
0.16ml |
凝胶缓冲液 |
1.50ml |
1.50ml |
0.60ml |
0.50ml |
50%甘油 |
1.50ml |
1.50ml |
0.60ml |
/ |
ddH2O |
/ |
0.14ml |
0.24ml |
1.34ml |
PAGE胶促凝剂 |
45μl |
45μl |
18μ| |
20μ| |
1 配制分离胶
1.1 将不同体积的双蒸水、49.5%Acr 、凝胶缓冲液和50%甘油加入到离心管中混合;
1.2 加入PAGE胶促凝剂,立即涡旋混匀5-10秒,以使溶液充分混匀;
1.3 在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液,然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 mm的水层,使凝胶表面保持平整;
1.4 静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
2 配制夹层胶(去除覆盖在分离胶上的水层,用滤纸将残留的水吸去)
2.1 将不同体积的双蒸水、49.5%Acr和凝胶缓冲液加入到离心管中混合;
2.2 加入PAGE胶促凝剂,立即涡旋混匀5-10秒,以使溶液充分混匀;
2.3 将适量的夹层胶溶液迅速加至分离胶的上面(对于1 mm的mini-gel,夹层胶溶液加约1 ml), 然后在夹层胶溶液上轻轻覆盖一层水层,使凝胶表面保持平整;
2.4 静置,待夹层胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
3 配制浓缩胶(去除覆盖在夹层胶上的水层,用滤纸将残留的水吸去)
3.1 将不同体积的双蒸水、49.5%Acr 和凝胶缓冲液加入到离心管中混合;
3.2 加入PAGE胶促凝剂,立即涡旋混匀5-10秒,以使溶液充分混匀;
3.3 将梳子插入凝胶内,避免产生气泡;
3.4 待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,以免破坏加样孔;
3.5 进行电泳操作。
4 电泳
4.1 将电泳槽放入4℃或冰水浴中;
4.2 外槽加入阳极缓冲液,内槽加入阴极缓冲液;
4.3 30V 预电泳10min;
4.4 将样品(已经过Tricine专用上样缓冲液处理)加入点样孔后30V 电泳1小时;
4.5 100V电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳;
4.6 进行后续的考马斯亮蓝染色或电转。