miRNA cDNA第一链合成试剂盒北京品牌

特别提示：包括miRNA cDNA第一链合成试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：miRNA cDNA第一链合成试剂盒
英文名称：miRNA cDNA Synthesis Kit
产品货号：WE0157
产品规格：25次

  本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾的方法来使miRNA具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，zuì终合成miRNA对应的第一链cDNA。

  miRNA cDNA第一链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)尾修饰过程及修饰后逆转录过程需要的全部试剂。该试剂盒具有非常高的Poly(A)修饰和逆转录效率，可以从1ng-2μg的total RNA中有效获得miRNA对应的cDNA第一链。并且操作简便、快捷，可以用于从一个反应合成的cDNA中同时检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。

试剂盒组成：

组份	25次
Tris-Hcl，1 mM，PH 8.0	1ml
E.coli Poly(A)Polymerase，5U/μl	15μl
10×Poly(A)Polymerase Buffer	80μl
ATP，10 mM	15μl
RT Primer，25μM	90μl
5×UltraRT Buffer	120μl
UltraPure dNTP Mix，10 mM each	30μl
UltraRT	15μl
RNase-Free Water	1ml

备注：本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒(WE0158)配套使用。

自备实验材料：1ng-2μg的总 RNA，或0.1ng-1μg的小分子RNA。

注意事项：
预防RNase污染，应注意以下几方面：
1、使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2、玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3、配制溶液应使用无RNase的水。
4、操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

使用方法：

A．miRNA加Poly(A)尾的过程：
1、首先根据所用RNA的量，按如下公式，用1 mM Tris(PH8.0)来稀释10 mM ATP：
ATP稀释系数=5000/__ng的总RNA
例：如果总RNA的起始用量为100ng，那么ATP稀释系数=5000/100=50。即将ATP稀释50倍(1μl的10 mM ATP加49μl的1 mM Tris，PH8.0)。
2、向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入以下试剂至总体积25μl。
 

试剂	25μl反应体系	终浓度
total RNA	Xμl	可达2μg
10×Poly(A)Polymerase Buffer	2.5μl	1×
第“1”步中稀释好的ATP	1μl	—
E.coli Poly(A)Polymerase, 5U/μl	0.5μl	2.5 U
RNase-Free Water	up to 25μl	—

注意：反应中使用的total RNA必须含有小分子RNA。

此过程也可以直接使用小分子RNA(建议加入量为2-5μl。请根据目的miRNA的丰度来确定加入量)。

3、轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。37℃，孵育15分钟。此过程结束后，立刻进行第一链cDNA的合成，或于-20℃暂存。如需长期保存，建议存放于-80℃。

B．修饰后的miRNA cDNA第一链合成的过程：
1、向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积20μl：
 

试剂	20μl反应体系
上述Poly(A)反应液	4μl
UltraPure dNTP Mix，10 mM each	1μl
RT Primer，25 μ M	3μl
5×UltraRT Buffer	4μl
UltraRT	0.5μl
RNase-Free Water	7.5μl

2、轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。42℃，孵育50分钟。
3、85℃，孵育5分钟，终止反应。合成的cDNA反应液可以直接进行荧光定量检测实验，也可以于-20℃保存备用。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

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