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- 百奥莱博
- MQ0063-EVS
- 北京
- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
474
- 英文名：
Y1HGold Chemically Competent Cell
- 保质期：
三个月
- 供应商：
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件：
-80℃
- 规格：
10×100μl/50×100μl
特别提示：包括Y1HGold酵母感受态细胞在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
产品名称：Y1HGold酵母感受态细胞
英文名称：Y1HGold Chemically Competent Cell
产品货号：MQ0063
产品规格：10×100μl/50×100μl
Y1HGold菌株是GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。
Transformation marker为：ura3，leu2；报告基因为：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA酵母单杂系统需要两种质粒配套使用：pAbAi和PGADT7。
质粒pAbAi的筛选标志为URA，用于表达pBait-AbAi construct(1~3个 bait DNA 序列重复串联后克隆到pAbAi中)；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
GAL4-AbA酵母单杂系统原理：Aureobasidin A(AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.2μg/ml)下即可对酵母产生毒性。
基因组中整合了pBait-AbAi的酵母菌株(Bait-Reporter Yeast Strains)，当猎物蛋白(Prey)结合到诱饵序列(Bait DNA)上，GAL4 AD就会激活 AbAr的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长。AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。
Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经pAbAi质粒检测转化效率>103cfu/μg DNA。
保存条件：-80℃
基因型：
MATα，ura3-52，his3-200，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4Δ，gal80Δ，met–，MEL1
操作说明：
1.取pBait-AbAi质粒5μg，BstBI或BbsI酶切1小时，回收。
2.取100 μl冰上融化的Y1HGold感受态细胞，依次加入预冷的线性 pBait-AbAi质粒1-5μg(体积不高于15μl)，Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴，重复一次)10 μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30度水浴30分钟(15 min时翻转6-8次混匀)。
3.将管放42度水浴15min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4.5000 rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。
5.ddH2O 50μl重悬，涂SD/-Ura平板,29℃培养72h。
6.挑取5-10个克隆，用PCR方法确定pBait-AbAi整合到Y1HGold基因组中，PCR阳性菌株在SD/-Ura平板划线，29℃培养72h，4℃保存，此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。
注意事项：
1.感受态细胞最好在冰上融化。
2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y1HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。
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文献和实验相关专题 酵母感受态细胞制备可以：(1)用于建立酵母转化体系;(2)用于酵母表达系统 构建;(3)用于酵母其他分子生物学研究。 一、试剂与耗材 1. 试剂 细菌用-酵母提取物(Fisher)、 细菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、细菌用-琼脂粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA
1.5ml缓冲液B，彻底混匀； 30℃水浴孵育1h； 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中； 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中； 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定； 3、毕氏酵母电转化法 （1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备 取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB
酿酒酵母感受态细胞的制备 （1）从YPD平板上挑取一个新鲜的酿酒酵母EBY100单克隆至10 ml YPD液体培养基，30℃，250 rpm 培养过夜。 （2）测定过夜培养物的OD600值为3.0~5.0之间。 （3）将10 ml YPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2~0.4。 （4）在28~30℃摇床中继续培养3~6 hr，使其OD600值达到0.6~1.0。 （5）于室温1500 g 离心5 min 收集酵母细胞，弃上清。 （6）用10 ml 洗液洗酵母
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