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DNA Quantification Kit(illumina)
长期
北京百奥莱博科技有限公司
收到本产品后,请立即置于-20℃避光
500×20μl
特别提示:包括文库定量试剂盒(illumina)在内,本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
组分 | 规格 |
2×Quant MasterMix (SYBR Green) | 4×1.25ml |
10×Library Dilution Buffer | 2×1 ml |
10×qPCR Primer Mix | 1 ml |
DNA Standard 1(20 pM) | 100μl |
DNA Standard 2(2 pM) | 100μl |
DNA Standard 3(0.2 pM) | 100μl |
DNA Standard 4(0.02 pM) | 100μl |
DNA Standard 5(0.002 pM) | 100μl |
DNA Standard 6(0.0002 pM) | 100μl |
50×ROX Reference Dye | 1 ml |
Nuclease-Free ddH2O | 5×1ml |
浓度类型 | 有效范围 |
摩尔浓度 | 20 pM~0.0002 pM |
质量浓度 | 5.93pg/μl~5.93×10-5pg/μl |
拷贝数浓度 | 1.20×107copys/μl~1.20×102copys/μl |
成分 | 20μl体系 | 终浓度 |
2×Quant MasterMix (SYBR Green) | 10μl | 1× |
10×qPCR Primer Mix | 2μl | 1× |
DNA Standard 1~6或稀释后的文库或灭菌蒸馏水 | 4μl | - |
50×ROX Reference Dye△1 | - | - |
Nuclease-Free ddH2O△2 | 至20μl | - |
仪器 | 浓度 |
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等 | 2×(例如:5 μl ROX/20 μl体系) |
ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7; Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等 |
1×(例如:0.4 μl ROX/20 μl体系) |
Roche仪器,Bio-Rad仪器,Eppendorf仪器等 | 无需添加 |
阶段 | 循环 | 温度 | 时间 | 内容 | 荧光信号采集 |
预变性 | 1× | 95℃ | 5min | 预变性 | 否 |
PCR反应 | 35× | 95℃ | 30sec | 变性 | 否 |
60℃ | 45sec△3 | 退火/延伸 | 是 | ||
熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage) |
NTC的CT值 | zuì大有效CT值 | CT可用的标准品梯度 |
CT(NTC)>CT(S6)+3 | CT(S6) | S1-6 |
CT(S6)+3>CT(NTC)>CT(S5)+3 | CT(S5) | S1-5 |
CT(S5)+3>CT(NTC)>CT(S4)+3 | CT(S4) | S1-4 |
CT(S4)+3>CT(NTC)>CT(S3)+3 | 体系存在污染,需更换体系重复实验 |
DNA Standard | Log[pM] | CT值 | 平均CT值 | △CT值*1 | ||
1 | Log[20] | 8.98 | 9.00 | 8.95 | 8.98 | - |
2 | Log[2] | 12.43 | 12.40 | 12.45 | 12.43 | 3.45 |
3 | Log[0.2] | 15.87 | 15.90 | 15.92 | 15.9 | 3.47 |
4 | Log[0.02] | 19.36 | 19.34 | 19.38 | 19.36 | 3.46 |
5 | Log[0.002] | 22.78 | 22.77 | 22.69 | 22.75 | 3.39 |
6 | Log[0.0002] | 26.09 | 26.07 | 26.33*2 | 26.08 | 3.33 |
NTC | - | 32.04 | 32.1 | 32.03 | 32.05 | - |
现象 | 原因分析及解决办法 |
扩增效率超出 90%~110%范围 |
若NTC与6号标准品的ΔCT值小于3或者5、6号两个标准品的ΔCT值小于3.1,且计算扩增效率超过100%,那么应是反应体系有污染。可根据NTC阴性对照的熔解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。绘制标准曲线时,应先根据NTC的CT值确定标准曲线有效CT值范围,舍弃受污染影响的标准品,使用剩余的有效标准品绘制标准曲线。 |
不恰当的基线(Baseline)设置会增大DNA Standard 1的CT值,进而影响扩增效率计算。手动调整基线(Baseline)为1-3循环,可解决此问题。 | |
移液不准确。 | |
R2<0.99 | 移液不准确。 |
所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 | |
仪器相关问题。确认所用ROX Reference Dye与定量仪器匹配。 | |
标准品扩增 曲线分布不均一 |
若5、6两个标准品的ΔCT值小于3.1,那么应是反应体系有污染。可根据NTC阴性对照的熔解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。 |
若1、2两个标准品的ΔCT值小于3.1,那么应是基线(Baseline)设置不当。手动调整基线(Baseline)为1~3。 | |
若DNA Standards之间的ΔCT值大于3.6,那么提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并彻底混匀;确认所有组分浓度正确以及反应程序无误。 | |
长时间强光照射会导致2×Quant MasterMix (SYBR Green)荧光下降,进而造成ΔCT大于3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。 | |
复孔重复性差 | 移液不准确。 |
所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 | |
仪器相关问题。确认所用ROX Reference Dye与定量仪器匹配。 | |
待测文库各稀释度 的ΔCT值与稀释 倍数差异不一致 |
移液不准确。 |
所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 | |
文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差,定量波动性大。 | |
文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用,用完丢弃。 | |
文库各稀释度计算 的初始文库浓度 差异超过10% |
移液不准确。 |
所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 | |
文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差,定量波动性大。 | |
文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用,用完丢弃。 | |
稀释文库CT值超 过标准曲线有效 CT值范围 |
若稀释文库的CT值小于1号标准品的CT值,那么提示文库稀释度不够,多见于过度扩增的文库。提高文库稀释倍数重复实验。 |
若稀释文库的CT值大于6号标准品的CT值,那么提示文库稀释度过高或构建失败。常规文库在1/10,000左右的稀释度时得到的CT值是不会超过6号标准品的CT值的。减少稀释倍数重复实验。 | |
1号标准品的CT值 异常 |
不恰当的基线(Baseline)设置会增大DNA Standard 1的CT值,进而影响扩增效率计算。手动调整基线(Baseline)为1~3循环,可解决此问题。 |
DNA Standards有 扩增,而文库没有 扩增或者CT值很大 |
文库接头序列错误,建议核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。 |
稀释度过高,建议减少稀释倍数,重复实验。 | |
文库降解,文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用,用完丢弃。 |
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