高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒

特别提示：包括高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒
英文名称：eECL Western Blot Kit
产品货号：WE0308
产品规格：50ml|250ml

  高灵敏度化学发光检测试剂盒是免疫印迹实验中与辣根过氧化物酶(HRP)配套使用的的高灵敏增强型检测试剂盒。该产品基于新一代增强型化学发光底物研制而成，在HRP的催化下产生高强度的信号，能够检测pg级别的抗原。灵敏度高、发光信号强烈持久，可以使用照相技术(X-光胶片曝光)或者其他成像方法(如荧光或化学发光成像仪)进行检测。

试剂盒组成：

组成	50ml	250ml
eECL-A(Luminol Enhancer)	25ml	125ml
eECL-B(Peroxide)	25ml	125ml

注意事项：
1、在与膜发生接触过程中，请佩戴手套且使用干净镊子等洁净器材，避免蛋白污染及高背景。
2、避光条件下，配制好的化学发光检测底物工作液可在室温下稳定保存8小时。阳光或其他强光会影响工作液，故应避免强光长时间的照射。正常实验室灯光短时间照射不影响工作液的使用。
3、百奥莱博提供多种蛋白转移用膜、封闭液、一抗、酶标二抗、缓冲液等，详情请查询公司网站。

操作步骤：
1、二抗孵育完毕后，将印迹膜充分洗涤。
2、根据需要量，将eECL-A和eECL-B按照1：1的比例等体积混合，配制为化学发光检测底物工作液(一张8 cm×6 cm的膜大约使用1ml工作液)。
3、弃去洗涤缓冲液，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖整张膜，室温孵育3-5分钟。
4、用移液器吸去多余发光底物工作液，将印迹膜置于两层干净的塑料薄膜之间，此过程应小心完成，避免膜与膜之间产生气泡。
5、在暗室内进行X-光胶片曝光，或将膜放置到化学发光成像仪内，按照仪器说明书进行检测。
 

问题	可能原因	解决方法
胶片反相(白色条带，黑色背景)	系统中HRP过量	稀释HRP标记物至少10倍以上
膜上出现棕色或黄色条带
暗室中看到强烈发光
发光信号持续时间过短
信号较弱或者无信号	发光反应系统中HRP 过多，消 耗底物过快，引起信号迅速降低	稀释HRP标记物至少10倍以上
	抗原/抗体量不够	增加抗原/抗体使用量
	蛋白转移率低	优化转移系统
高背景	系统中HRP 过量	稀释HRP标记物至少10倍以上
	封闭不足	优化封闭程序
	封闭试剂选择不当	选择另一种封闭试剂
	冲洗不充分	增加冲洗时间，次数
	曝光过度	减少曝光时间
	抗原/抗体浓度过高	降低抗原/抗体使用浓度
蛋白条带为点状	蛋白转移失败	优化转移过程
	膜未平衡	按照说明书处理膜
	胶片与膜之间有气泡	曝光前去除所有气泡
出现非特异条带 (高背景、信号维持时间较短)	系统中HRP过多	稀释HRP标记物
出现非特异条带 (背景干净信号维持时间正常)	一抗用量过多	进一步稀释一抗
	SDS 导致非特异结合	在实验过程中避免使用SDS

储存条件：2～8℃，避光保存

除了高灵敏度ECL化学发光检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：蛋*磷酸酶抑制剂混合液Ⅱ
货号：BTN130525
规格：1mL
组织/细胞裂解时会释放出大量内源性蛋*磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异，影响实验结果。因此，加入外源性蛋*磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维持蛋白质的磷酸化状态，是Western Blotting、免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质和蛋白激酶活性测定等研究不可缺少的一步。本产品就是针对这一用途开发。

产品特点：
1. 即开即用，不需要单独购买每个成分然后再配制。
2. 由多种蛋*磷酸酶抑制剂组成，各成分的浓度经过精心优化。
3. 抑制谱广，能特异性地抑制酪氨酸磷酸酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶，zuì大限度保持蛋白质磷酸化。
4.与各种动物细胞裂解液兼容。
5. 使用简单，在细胞裂解液中按一定比例加入即可(根据蛋*磷酸酶决定，一般按1/100的体积比)。
6.适用于Western blot、免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定和信号传导等试验。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在临用前溶解本产品，并按1/100的比例加入到细胞裂解液中(1mL细胞裂解液中加入10μL)。注意：对蛋*磷酸酶含量特别丰富的组织，可以将加入比列提高到1/20-1/50。
2.后续动物细胞提取和蛋白组学处理按常规方法进行即可。

注意：避免反复冻融本产品，所以第一次溶化后，如果还有剩余，可将其分装成小份冻存，每次用多少取多少。

名称：细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒
货号：SY0327
规格：50T
细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒用于快速便捷分离细胞/组织细胞膜和细胞浆蛋白，抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜以及高尔基体膜等上的膜蛋白。主要工作原理：通过匀浆适度破碎细胞，经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。整个过程仅需约90min即可完成，抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性测定等后续实验。

膜蛋白抽提试剂中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和EDTA等，后续不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定，但抽提获得的膜蛋白或细胞浆蛋白适合用于检测蛋白的磷酸化水平。

按照说明书步骤的用量（细胞2-5×107个；组织约100mg），SY0327可分别进行50个样品的抽提，具体用量可根据不同的样品体积进行调整。

试剂盒组份：
试剂A：50ml
试剂B：15ml

储存条件：-20℃，有效期一年。

注意事项
1）客户需自备PMSF，PMSF需现配现用，建议在抽提试剂加入到样品前2-3min加入，以防失效。
2）利用本试剂盒抽提到的细胞膜/细胞浆蛋白可直接用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)（Yeasen Cat#20201）测定其浓度，但不适合用Bradford法测定。
3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法
室温融解并混匀试剂A和B，融解后立即置于冰上。取适量的试剂A和B备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使其zuì终浓度为1mM。

1 样品准备
1）细胞样品
① 细胞收集
贴壁细胞：培养细胞约2-5×107个，PBS清洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
【注】：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。
悬浮细胞：培养细胞约2-5×107个，离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
② 细胞清洗
用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5min沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1min，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，尽zuì大努力吸尽残留液体。
③ 细胞预处理：把1ml试剂A(含PMSF)加入至上述细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10-15min。
2）组织样品
取约100mg组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1ml试剂A(含PMSF)，轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置10-15min。【注】：如果组织样品比较少，也可以使用更少的组织量，例如30-50mg，后续试剂的用量及操作步骤不变；组织用量较少时，zuì后获得的膜蛋白也较少。

2 样品的破碎及破碎效果的鉴定
① 样品匀浆：把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30-50下。【匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。】
② 通常在匀浆30次后取约2-3µl匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环(A shiny ring around the nuclei)或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。
【注】：如果没有适当的玻璃匀浆器，对于培养的细胞也可以采用反复冻融法来破碎细胞。把样品在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。如果细胞破碎的程度不足70%，可增加冻融次数，直到细胞破碎的程度大于70%。

3 去除细胞核和未破碎的细胞
在4℃，700g离心10min，小心收集上清液至一新的离心管中。【注】：吸取上清时切勿接触沉淀！可以有约30-50µl上清液残留不予吸取，以保证吸取的上清液有较高的纯度。

4 沉淀细胞膜碎片
在4℃，14000g离心30min，以沉淀细胞膜碎片。

5 收集细胞浆蛋白
吸取上清至1新的离心管中，即为细胞浆蛋白，可-70℃保存备用。吸取上清时可以有30-50µl上清残留，以避免接触沉淀导致上清样品被污染。

6 抽提膜蛋白

4℃，14000g离心10sec，尽zuì大努力吸尽上清。可以轻轻触碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀。加入试剂B 200µl(如有必要，也可加大到300µl)，zuì高速剧烈Vortex 5sec重悬沉淀，冰浴5-10min。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4℃，14000g离心5min，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。可-70℃保存备用。对于一些有特殊用途的膜蛋白，可自行配制适当的膜蛋白抽提试剂进行膜蛋白抽提。