非蛋白质巯基含量检测试剂盒 微量法

非蛋白质巯基含量检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC1435
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液一	液体30 mL×1瓶	2-8℃保存
提取液二	液体30 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体30 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	粉剂×1瓶	2-8℃保存
标准品	粉剂×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 提取液的配制：将提取液一和提取液二按体积比1：1的比例混合配制，按照样本数量配制并在当天用完；
2. 试剂二：临用前加入2 mL无水甲醇充分溶解备用，4℃可保存八周；
3. 标准品：10 mg半胱氨酸，临用前加入1.65 mL提取液配制成50 µmol/mL的半胱氨酸标准溶液备用，2-8℃可保存1个月。

产品说明：
生物体内巯基主要包括非蛋白质巯基和蛋白质巯基。巯基化合物在体内具有重要的解毒功能，对生物体的自我调节具有非常重要的生理意义。

巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝*酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰。

技术指标：
最低检出限：0.0061 μmol/mL
线性范围：0.00625-0.8 μmol/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、甲醇、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 动物、植物组织：称取约0.1g，加入1mL的提取液，制备成10%的匀浆，10000g，常温离心10min，取上清置冰上待测。
2. 细胞或细菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细胞（功率200w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min），然后10000g，常温离心10min，取上清置冰上待测。
3. 血清（浆）、培养液等液体样本：向0.1mL血清（浆）、培养液等液体样本中加入1mL提取液，10000g，常温离心10min，取上清置冰上待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计用蒸馏水调零。
2. 标准品的制备：将50μmol/mL标准溶液用提取液稀释至0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL 的标准液待测，现用现配，具体稀释可参考下表。

序号	稀释前浓度（µmol/mL）	标准液体积（µL）	提取液体积（µL）	稀释后浓度（µmol/mL）
1	50	100	900	5
2	5	80	920	0.4
3	0.4	200	200	0.2
4	0.2	200	200	0.1
5	0.1	200	200	0.05
6	0.05	200	200	0.025
7	0.025	200	200	0.0125
8	0.0125	200	200	0.00625

备注：实验中每个标准管需60µL标准溶液。

1. 操作表

试剂名称	对照管	测定管	标准管	空白管
上清液（μL）	60	60	-	-
标准溶液（μL）	-	-	60	-
试剂一（μL）	130	130	130	130
试剂二（μL）	-	20	20	-
蒸馏水（μL）	20	-	-	80
涡旋混匀，室温准确反应10min，吸取200μL于微量比色皿/96孔板中测定412nm吸光值，分别记为A对照、A测定、A标准、A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照，算ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照管，标准曲线和空白管只需测1-2次。

三、计算公式

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

1. 非蛋白质巯基含量计算：

1. 按样本质量计算

非蛋白质巯基含量（µmol/g 质量）=x×V提取÷W=x÷W

1. 按血清、培养液体积计算

非蛋白质巯基含量（µmol/mL）=x×（V提取+V液体）÷V液体=11×x

1. 按细胞数量计算

非蛋白质巯基含量（μmol/10⁴ cell）=x×V提取÷500=0.002×x
V提取：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr，样本蛋白浓度，mg/mL；500：500万个细胞；V液体：血清（浆）或培养液体积，0.1mL。

注意事项：
如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。
实验实例：

1. 取0.1g小鼠肾脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.457-0.061=0.396，带入标曲y=2.4988x+0.0666，得出x=0.1318，按样本质量计算含量得：

非蛋白质巯基含量（µmol/g质量）=x÷W=0.1318÷0.1=1.318µmol/g 质量。
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