WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒

特别提示：包括WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
产品货号：HR0486
产品规格：250T/500T/1000T

WST-1 是广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂。WST-1 是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT 类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。
首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1产生的formazan 比XTT和MTS产生的formazan 更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS 更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。WST-1 使用时无须同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解formazan。WST-1对细胞无明显毒性。加入WST-1 显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。

储存条件：2-8℃避光保存。
注意：
1．WST-1短期存放于2-8℃，长期存放请分装后-20℃避光保存。
2．避免反复冻融。
3．冻存后溶解时注意重新混匀。
有效期：一年。

注意事项：
●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

产品特点：
● 使用方便：仅使用单一试剂；
● 结果稳定：试剂本身稳定性高，实验结果稳定可靠；
●线性范围更宽，灵敏度更高。

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ● 纯水 ● 移液器及吸头
● CO2培养箱 ● 带有450nm滤光片的酶标仪
使用注意事项：
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。
●有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。
● 若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH 发生变化，建议更换新鲜的培养基后再加WST-1试剂。含有酚红的培养基可用于本试剂盒做细胞活性的测定。
● 如果不是使用96孔板检测，WST-1溶液的用量相应等比例增加即可。

使用方法：
1．加细胞悬液100μl(约5000-10000个细胞)到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)。每板设对照(加100μl培养基)。
2．置37℃，5% CO2 孵育过夜，倒置显微镜下观察。
3．每孔加入10 μl待检测药物溶液,37℃孵育。
4．每孔加入10 μl WST-1溶液，37℃孵育1-4小时。
5．测定450 nm 各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用430-480nm的滤光片。
5．同时设置空白孔(培养基和WST-1溶液，无细胞)，对照孔(不加药培养基和WST-1溶液，有细胞)，每组设定3-5 复孔。
常见问题：
1．每孔接种细胞数量多少？
标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量为1,000个/孔 (100 μl培养基)。预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入试剂。
2．酚红和血清影响实验结果吗？
酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
3．测定时间为多少合适？
试剂对于不同的细胞灵敏度是不同的。因此不同细胞的最佳测定时间不一样，一般贴壁细胞0.5-3小时，悬浮细胞2-4小时，部分细胞时间更长。
4．实验中吸光值太高怎么处理？
在实验中如果吸光值太高，可以减少细胞数量和缩短加入试剂后的培养时间。贴壁细胞染色比较容易，细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
5．需要设定参比波长吗？
不一定需要设定。为了查出样品浑浊等原因导致的本底吸收，可以设定600nm以上的参比波长做双波长测定，此时试剂无吸收。

除了WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：TUNEL检测阳性对照制备试剂盒(可配套TUNEL系列试剂盒使用)
货号：KFS196
规格：20T|200T
TUNEL 检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。可使用本试剂盒制备阳性片（使用客户自备样本），其后续步骤与待测样本同样进行。

名称：Caspase 6分光光度法检测试剂盒
货号：KFS204
规格：20T|50T|100T
本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织caspase-6 检测。Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。Caspase-6 是级联酶的下游分子，被Caspase-9 激活后，激活下游Larmin A 的活性，导致细胞形态发生皱缩及细胞膜渗漏。Caspase-6 在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段时则被激活。Caspase-6 分光光度法检测试剂盒就是将caspase-6 序列特异性的多肽偶联至发色基团，当该底物被caspase-6 剪切后，发色基团即游离出来，可通过酶标仪或分光光度计（λ=405nm 或400nm）测定其吸光值，可考察caspase-6 的活化程度。

注意事项
1. Caspase-6 Substrate 避光保存及使用。
2. 对某些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡可能存在非依赖于Caspase-6 活化的机制，这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-6 活性无明显改变，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。
3. 细胞数量需达到3~5×106 个或新鲜组织50~100mg，以便能达到测定需要的100~200μg 蛋白的要求，因为Caspase-6 的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的OD 值偏低，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

名称：Annexin V-Alexa Fluor 488/PI双染细胞凋亡检测试剂盒
货号：HR0405
规格：20T/50T/100T
产品背景：
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。
AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS 高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
检测原理：
用标记了Alexa Fluor 488的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合Annexin V-Alexa Fluor 488。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，Propidium iodide(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI 能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与Annexin V-Alexa Fluor 488和PI 结合显色，而PI 则被排除在活细胞(Alexa Fluor 488阴性)和早期凋亡细胞(Alexa Fluor 488阳性)之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被Alexa Fluor 488和PI 结合染色呈现双阳性。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(Alexa Fluor 488-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(Alexa Fluor 488+ /PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(Alexa Fluor 488+ /PI-)。
Annexin V-Alexa Fluor 488 细胞凋亡检测试剂盒可以方便快捷的检测凋亡细胞，使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。

储存条件：2-8℃避光保存。
长期保存于-20℃避光。长期多次使用可分装保存，避免反复冻融。
有效期：一年。

注意事项：
● 请在使用前仔细阅读并参考该说明书。
●本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● Annexin V-Alexa Fluor 488和Propidium iodide是光敏物质，请注意避光。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

产品特点：
● 方便：可用流式细胞仪或荧光显微镜检测；
●快速：1小时内即可完成实验；
● 准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。
检测方法：
流式细胞仪或荧光显微镜
样本类型：
● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ● 纯水 ● 移液器及吸头 ●离心机 ● 流式细胞仪或荧光显微镜
使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
● Annexin V-Alexa Fluor 488和Propidium iodide 是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。
● 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。
● 使用Annexin V-Alexa Fluor 488试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不需要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。
● 如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200×g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合。
● 流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1×105。
● 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS 洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-Alexa Fluor 488，最终导致染色失败。
●对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-Alexa Fluor 488的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA影响Annexin V与PS的结合。
● 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS 翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。
●有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度很低，难以染色，此时不适合用Annexin V方法检测凋亡。

使用方法：
样品染色：
1．离心收集悬浮细胞。离心机300g，2-8℃，离心时间5min，弃培养基。(贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性)。
2．用冷PBS 洗涤细胞两次。(300g，2-8℃，离心时间5min 收集细胞)。
3．用纯水稀释10×binding buffer 为1×binding buffer。
4．用400μl 1×Annexin V binding buffer 悬浮细胞，浓度大约为1×106 cells/ml。
5．在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-Alexa Fluor 488染色液，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。
6．加入10μl PI染色液后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5分钟。
7．立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
流式细胞仪分析：
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。激发波长为488nm。
按照常规的流式凋亡检测的操作即可。Annexin V-Alexa Fluor 488的绿色荧光信号可以通过FL1(FITC 接收器)通道检测；PI 红色荧光在620nm，通过FL2(Propidium iodide 接收器)通道或FL3 通道检测。
注：具体流式设置按常规方法即可。也可联系本公司索取供参考的详细步骤。
荧光显微镜观察：
1．滴加30-50μl用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
注：对于贴壁细胞，可以象悬浮细胞那样染色后,滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。也可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内培养，然后诱导细胞凋亡。细胞染色在细胞培养板内进行。先用PBS 冲洗两次，加入400μl 1×Annexin V binding buffer 于孔中。再加入5μlAnnexin V-Alexa Fluor 488染色液与10μl Propidium Iodide染色液，混匀。避光室温反应10分钟。
2.在荧光显微镜下用双色滤光片观察。使用荧光显微镜上的FITC滤镜(蓝光)，Annexin V-Alexa Fluor 488染色阳性的细胞将在细胞膜表面呈现明亮的苹果绿色。使用Rhodamine滤镜(绿光)，Propidium Iodide染色阳性的细胞则会在整个胞质内呈现不同强度的黄-红色。早期凋亡细胞不会被Propidium Iodide染色或显示背景荧光，而坏死或晚期凋亡细胞则会显示出黄-红色的胞质，红色的胞核和环绕细胞的绿色胞膜。在晚期凋亡细胞中还可以观察到胞膜皱缩和起泡。
常见问题分析：
实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。
● 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
● 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS的结合需要Ca2+离子，1×binding buffer中含有Ca2+，EDTA的消化会影响染色，建议使用无EDTA的胰酶，或者消化后用PBS 洗涤干净。
● 细胞离心用冷PBS 洗涤后，应尽量吸干残余液体，残余过多的PBS中含有磷酸根，会形成磷酸钙沉淀，影响Annexin V的染色。
● Annexin V binding buffer 瓶盖要盖紧密封，长时间暴露于空气后，空气中的CO2 进入后形成CaCO3 会产生沉淀，从而减少游离的Ca2+，导致实验的结果不佳。
● 污染其他的缓冲液。如吸取PBS 后不更换Tip 头会导致游离的Ca2+的减少，从而导致实验的结果不佳。
●阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并检测，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。
实验过程中阳性率偏高。
● 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。
若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验。
● 细胞操作不当。贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏，使得假阳性偏高。
● 凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。