CellTrace染色检测淋巴细胞增殖

细胞增殖是生物体的重要生命特征，生物以细胞细胞分裂的方式产生新的细胞，补充体内已经衰老和死亡的细胞，用以维持新陈代谢，同时细胞增殖也是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。故细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。细胞增殖检测技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学、免疫学、药学等研究领域。

目前常用的细胞增殖检测方法有MTT、CCK-8、Edu检测法等。下面就针对于这三种常用检测方法的注意事项做一综述。

方法/步骤

1. MTT检测法

   1.       MTT的配制：MTT对菌和光十分敏感，配制过程中注意无菌环境及避光，使用超净台配制时，可以将超净台的灯光先关掉。最好现用现配，避光4℃保存两周内有效，也可配置成储存液，-20℃保存，避免反复冻融。MTT具有致癌性，在配制的过程中，应注意防护，避免药物直接触碰皮肤。

   2.       细胞接种密度的确定：选择适当的接种密度，若密度太大，细胞对药物敏感性降低；若密度过小，则差异性太小。细胞密度控制在103-104之间。

   3.       血清的影响：高浓度的血清会对细胞的光吸收值长生影响，故细胞培养使用的血清浓度应该控制在10%以下。

   4.       设置凋零空和空白组，保证实验结果的准确性。

   5.       使用96孔板接种培养时，合理分配96孔板的位置，四周的孔用PBS来填充，因为置于培养箱中培养时，边缘孔的水分蒸发会很快，药物易被浓缩，加入PBS可以从一定程度上保证实验孔的水分。

   6.       注意测试药物是否与MTT发生反应：某些具有氧化还原性质的药物，会与MTT发生反应，将MTT还原成为棕褐色沉淀，故如存在此类药物，应在加入MTT前，用PBS对细胞清洗。

   7.       终止培养，溶解结晶：去除上清时，切记勿将MTT结晶体吸走，操作慎重，以免影响吸光值。可使用平板离心机将96孔板进行离心，或将培养板倾斜放置，用枪头尖部慢慢小心将上清液去除。

2. CCK-8检测法

   1、  根据所培养细胞的种类和细胞数量来确定细胞培养时间。细胞培养1-4小时后，可先从培养箱中取出，目测或使用酶标仪观察染色程度，若染色不充分，再将细胞放入培养箱中继续培养。

   2、  保证培养箱和培养板中间孔的湿度。培养板中间孔的湿度可以使用PBS填充边缘孔的方法来解决。

   3、  添加CCK-8试剂时，速度要快，避免药剂在墙头上停留时间过长，对药物浓度产生影响。也可在加样前用培养基稀释CCK-8。

3. Edu检测法

   1、  加入含有Edu的培养基时，培养基的用量以没过细胞为适宜。

   2、  根据培养细胞种类不同，确定细胞生长周期，再进一步确定Edu培养基的培养时间，大多数细胞为2小时培育时间。

   3、  固定细胞前，使用PBS清洗未进入细胞DNA的Edu，一般清洗次数为1-2次，每次5分钟，也根据不同的细胞选择清洗强度，避免细胞流失，造成密度不同。

   4、  染色完成后，最好立即进行观察 。如若条件限制，请4℃避光保存，保存时间不宜过长，不超过3天。

注意事项

• 目前应用较多的是CCK8法
• 必要时可使用abmole的CCK8试剂盒