RNA专用转染试剂-RNAFit

介绍：RNAFit是一种功能强大的siRNA / miRNA转染试剂，可确保在哺乳动物细胞中进行有效的转染和基因沉默，并且具有高重复性的结果。在绝大多数的细胞（如HeLa，MCF7或NIH-3T3）中使用RNAFit转染1 nM siRNA，就能达到超过90％的转染效率；对于难以转染的悬浮细胞系如K562或THP-1细胞，使用RNAFit转染终浓度为5 nM的siRNA，也可以观察到超过80％的转染效率。



1贴壁细胞转染siRNA操作步骤
1.1接种细胞
为了使用RNAFit转染贴壁细胞取得最佳的转染效果，需要提前一天将细胞接种到相应的培养板中，以转染时细胞汇合度达到30-50％为宜。（推荐接的细胞数量参见表1）

培养板规格	接种细胞数量	每孔表面积	培养基体积
96-well	5 000 ± 2 500	0.3cm2	0.2 ml
24-well	25 000 ± 10 000	1.9 cm2	1 ml
12-well	50 000 ± 20 000	3.8 cm2	2 ml
6-well / 3.5 cm	150 000 ± 50 000	9.4 cm2	4 ml
6 cm 培养皿/25cm2培养瓶	400000 ± 100000	25 - 28 cm2	8 ml
10 cm培养皿 / 75 cm2培养瓶	1 x 106 ± 250 000	75 - 78.5 cm2	15 ml
14 cm培养皿 / 175 cm2培养瓶	2 x 106 - 5 x 106	153 - 175 cm2	20 ml

                         表1.转染前一天推荐接种的细胞数
1.2 贴壁细胞转染
为了达到高的基因沉默效率，我们建议siRNA浓度范围为1 nM至10 nM，因为最佳siRNA浓度和靶基因本身、细胞类型、siRNA效力、靶mRNA的半衰期等有很大关系。需要注意的是，在较低的siRNA浓度下，脱靶率通常最低。 RNAFit的用量应根据siRNA浓度和培养皿规格进行调整，见表2。
 

培养板规格	siRNA（pmoles）/孔	siRNA（ng）/孔	RNAFit 体积	无血清培养基体积	完全培养基体积	总体积
96-well	0.17	2.4 ng	0.75 ± 0.5 µl	50 µl	125 µl	175 µl
24-well	0.6	8.4 ng	2 ± 1 µl	100 µl	500 µl	600 µl
12-well	1.2	17 ng	4 ± 2 µl	200 µl	1 ml	1.2 ml
6-well /3.5 cm	2.2	31 ng	8 ± 4 µl	200 µl	2 ml	2.2 ml
6 cm / 25 cm2培养瓶	4.4	62 ng	15 ± 5 µl	400 µl	4 ml	4.4 ml
10 cm / 75 cm2培养瓶	10.5	147 ng	40 ± 10 µl	500 µl	10 ml	10.5 ml

                 
                      表2.1nM siRNA时各种细胞培养容器的推荐转染条件

2 疑难解答
 

问题	解决建议
较低的沉默效率	增加每孔中siRNA浓度。
	增加每孔中RNAFit的量。
	检测转染24h~96h的不同时间点的沉默效率。
	用opti-MEM稀释siRNA。
	确保贴壁细胞在转染当天汇合度达到30-50％。对于小细胞和生长缓慢的细胞类型，每孔中接种约2倍数量的细胞以达到足够的汇合度。
	确认所有试剂是否不含RNase。
	确保siRNA是高质量的（PAGE纯化和脱盐）。
	确认siRNA双链体的浓度和退火条件。
	将转染期间的培养基体积减少一半并低速离心培养板（180g，5分钟）。 4小时后，加入0.5毫升培养基。
细胞毒性	通过在转染后4至6小时更换培养基或简单地向培养基中添加新鲜培养基，减少RNAFit/ siRNA复合物与细胞的孵育时间。
	减少转染试验中使用的RNAFit的体积。
	核实沉默靶基因后是否不影响细胞活力。