注意事项:请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.下列操作步骤适用于模板量为50ng-2μg的总RNA,如果总RNA量大于2μg,请按比例扩大反应体系。
2.在冰上进行操作,防止RNA发生降解。
3.不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板,推荐使用变性步骤,即在操作步骤之前,将模板RNA在65℃孵育5min后迅速转移到冰上,进行下一步操作。
4.根据实验需求不同,也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer,引物使用量如下:Oligo-dT Primer 50pmol/20 μl反应体系,Gene Specific Primer 5 pmol/20 μl反应体系。
5.使用Gene Specific Primer时,反转录反应可设置为42℃,15min。当PCR反应有非特异性扩增时,将反转录温度升到50℃会有改善。
6.反转录体系可以根据需要相应扩大。