Tth DNA聚合酶

Tth DNA聚合酶 热敏感受态细胞操作说明：
1.感受态细胞放置冰中融化（或放手心或室温片刻，待菌体处于冰水混合状态时迅速插入冰中），加入目的 DNA（质粒或连接产物）并用手拨打 EP 管底轻轻混匀，冰上静置 25 分钟。2. 42℃水浴热激 45 秒，迅速放回冰上并静置 2 分钟，晃动会降低转化效率。
基因型简要说明:
操作说明
3. 向离心管中加入 700μl 不含抗生素的无菌培养基（2YT 或 LB），混匀后 37℃，200 rpm 复苏 60 分钟。
4. 5000rpm 离心一分钟收菌，留取 100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的 2YT 或 LB 培养基上。
5.将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放 37℃培养至少 17h。
Tth DNA聚合酶 注意事项
1.感受态细胞最好在冰上融化。
2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
电击感受态细胞简要说明：
电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。菌株能保证高拷贝质粒稳定复制，recA1 和 endA1 的突变有利于插入 DNA 的稳定和高纯度质粒 DNA 的提取。hsdR17 突变导致 EcoK 核酸内切酶系统缺失，增强了外源 DNA 的稳定性和提取质量。M15的存在使 XL1-Blue 菌株可用于蓝、白斑筛选。此菌株具有四环素抗性。电击感受态细胞适用于各种文库构建，经特殊工艺制作，pUC19 质粒检测转化效率可达 1×1010 cfu/μg DNA。
Tth DNA聚合酶  操作说明：
1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，待其沥干水分，正置 5 分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置 5 分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的 XL1-Blue 电击感受态细胞插入冰中 5 分钟，待其融化，加入目的 DNA (质粒或连接产物)并用手拨打 EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19；  B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀 DNA 后加入适量 T 缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA 浓度不超过 100ng/μl，体积不超过 5μl/50μl 感受态。
3. 用 200 μl 枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。
4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为 BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。 5. 2 分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入 700 μl 不含抗生素的无菌 S.O.C. 培养基（室温），用 1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到 50ml 离心管（BD Falcon50ml 锥形离心管等），向离心管中补加 S.O.C. 培养基至 5ml。37℃，225 rpm 复苏 60 分钟。
6. 5000rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个）。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养 13-17 小时。
Tth DNA聚合酶  注意事项：

1. 加入 DNA 时体积不应大于感受态体积的 1/10。
2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。
3. 当 DNA 不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。
4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和 DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

6. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀 DNA 后用适量 TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证 DNA 浓度不超过 100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。
7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头 (普通 200ul 枪头应剪去枪头尖 0.6cm) 避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。