Klenow片段(无核酸外切酶活性)

特别提示：包括Klenow片段(无核酸外切酶活性)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Klenow片段(无核酸外切酶活性)
英文名称：Klenow Fragment(exo-)
产品货号：MT0031
产品规格：250U|2500U

Klenow片段是DNA聚合酶I的N末端截短物，本制品经过改造无任何外切酶活性，仅包含了DNA聚合酶活性，广泛应用于用随机引物制备探针、随机引物法标记、cDNA第二条链的合成等试验。需要注意的是该酶不能用于产物平端不齐。

产品组成：

组分	250U	2500U
Klenow Fragment(exo-)（5 U/μl)	50μl	500μl
*10×Klenow Buffer	1ml	1ml×2

*10×Klenow Buffer: 500 mM Tris-HCl（pH 8.0 at 25 ℃), 50 mM MgCl2, 10 mM DTT.该酶兼容PCR Buffer和内切酶Buffer。

保存条件：-20℃，有效期3年。

单位定义：一个活力单位即在37℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。

热失活：75℃，20分钟失活。

除了Klenow片段(无核酸外切酶活性),，我公司还供应以下相关产品：



名称：可逆型Taq DNA聚合酶抑制剂
货号：BTN60901
规格：0.3mL
Taq DNA聚合酶是进行PCR的zuì常用工具酶，但是由于它在常温下还是具有部分活性，所以经常会出现非特异的扩增产物，尤其是当PCR反应体系中有大量非特异DNA存在的时候。目前zuì常见的解决方法是使用抗Taq DNA聚合酶的抗体和使用经过化学修饰的热启动Taq DNA聚合酶(如AmpliTaq Gold)，但前者的缺点是加热后抗体会不可逆失活，后者的缺点是需要预热处理使酶激活。

产品特点：
1.可逆抑制Taq DNA聚合酶的活性，即常温抑制Taq酶活性，在45℃以上抑制功能丧失，当温度降低到45℃以下后，抑制活性又得以恢复。
2. 耐热，产品本身为非蛋白质试剂，远比Anti-Taq抗体稳定，便于保存和运输。
3. 使用简单，在加Taq酶前将本产品按PCR反应体积的1/10直接加入即可。
4.适用范围广，除Taq DNA聚合酶外，还可用于抑制其他DNA聚合酶的活性，如：Tth pol、Stoffel片段、Tfl pol、Tbr pol等。而一种酶的抗体一般对另一种酶的活性没有抑制作用。
5.与后续的RT-PCR兼容。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
在加入Taq或Tth DNA聚合酶之前，按PCR反应终体积1/10的比例将本产品加入到反应体系中混匀，然后再加入DNA聚合酶，启动PCR反应。

名称：dNTP混合溶液(10 mM)
货号：WE0159
规格：1ml|5ml
  本产品为高质量的脱氧核苷酸(dNTP)的混合物，包括等摩尔的dATP、dGTP、dCTP、dTTP。经过PCR检测的脱氧核苷酸，可与所有的耐热聚合酶配套使用。其中高纯dNTP纯度均达到99%以上，超纯dNTP纯度均达到99.9%以上，不含DNase和RNase。

使用方法：
dNTP(10 mM each)可直接使用，或用调节至中性(PH7.5 左右)的无菌超纯水稀释至适当浓度使用。可用于PCR反应、Real-time PCR、DNA序列测定、分子标记、cDNA合成等。

储存条件：-20℃。

名称：耐热逆转录酶II
货号：SY0294
规格：2000U
Reverse Transcriptase（第二代耐热逆转录酶）是Reverse Transcriptase（第一代耐热逆转录）的升级产品，是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新耐热逆转录酶。与上一代相比，进一步大幅提高了热稳定性，50℃下半衰期超过240min，并长时间耐受55℃高温且保持稳定，非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外，增加了多个突变位点，进一步增强了模板亲和力和行进性，大幅提升全长cDNA的合成能力，可获得长达20 kb的cDNA。另外，对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

活性定义：以Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10min内，掺入1 nmol的dTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位（U）。

质量控制
核酸外切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在37 ºC下孵育1h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：200 U本品和1 μg小鼠肝脏总RNA在37 ºC下孵育1h，RNA电泳谱带不发生变化。
功能检测1：逆转录体系中加入200 U本品，以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，50 ºC反应30min。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
功能检测2：逆转录体系中加入200 U本品，以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23为引物，55 ºC反应45min。取10% cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。
功能检测3：逆转录体系中加入200 U本品，以1 pg-1 μg Hela cell total RNA为模板，Oligo(dT)23VN和Random Hexamers为引物，测试qRT-PCR 性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间。

准备工作
1. 防止RNase污染：请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free。
2. 引物选择：
2.1 后续实验为PCR
a, 如果模板为真核生物来源，一般情况下首*Oligo dT18，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得zuì高产量的全长cDNA。
b, 基因特异性引物 (GSP)的特异性zuì高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新进行逆转录。
c, Random hexamers特异性zuì低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。
2.2 后续实验为qPCR
a, 将Oligo dT18与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。