HiFi Taq DNA 连接酶              

HiFi Taq DNA 连接酶是一种高保真热稳定型连接酶，由 DNA 连接酶和专利试剂混合而成。该酶能高保真且高效连接 DNA 切刻位点，其保真性没有任何酶能与之相比。在优化的缓冲液体系中，该酶将具有5´-磷酸基和3´-羟基的切刻位点

以磷酸二酯键进行连接，极大程度降低了错配率(1)。改良的配方使得该产品可以更好的识别连接反应供体和受体，从而可以精确检测 SNPs 和其他等位基因变异。HiFi Taq DNA 连接酶在37–75℃ 温度范围内都有活性(2,3)。



使用我们的在线工具Thermostable Ligase Reaction Temperature Calculator, 可以帮助您选择 HiFi Taq DNA 连接酶的最适反应温度。

图1: HiFi Taq DNA 连接酶可提高反应保真度

(A)反应底物池示意图。每一个底物池都包含一条特定序列、4条上游探针及4条下游探针（ FAM-标记）。特定序列与探针互补，在连接酶作用的互补位点处有两个特定碱基( NN,如 AA, AC, AG…)。每条探针的连接端为不同碱基，且每条探针的长度各不相同，从而能够在连接反应完成后通过毛细管电泳对产物进行分离与分析。对每天特定序列而言，有16种可能的不同底物组合方式。

(B) Ampligase连接酶 (Epicentre)、Taq DNA 连接酶和 HiFi Taq DNA 连接酶保真性对比：使用图 (A) 中所列出的底物池，在含有1X 反应缓冲液的 50 μl 反应体系中加入1 μl 连接酶，于 55℃ 反应30 min。横坐标代表某一特定的序列，纵坐标代表某一对含有相应碱基的探针连接而成的产物。每一个点代表检测到的一个连接产物（如上图）。从左上到右下的对角线代表了完全按照沃森-克里克碱基配对原则形成的连接产物；其他所有区域代表发生了碱基错配的连接产物。 Taq DNA 连接酶和 Ampligase 在相同反应条件下，表现比较类似，都会产生一定量的错配连接产物。而 HiFi Taq DNA 连接酶则显示出明显较少的错配产物，同时可以保持较高的产量。(图片来源见参考文献1)。

图 2: HiFi Taq DNA 连接酶表现出更强的双端错配识别能力



将靶定 λ 整合酶基因中35 bp 片段的探针与16.7 fmol λ 基因组 DNA 孵育，用 SYBR® Green qPCR 法检测连接产物中的错配几率。 HiFi Taq DNA 连接酶 (NEB #M0647) 显示出比 Taq DNA 连接酶 (NEB #M0208) 和 Ampligase 更高的保真度。图中显示，与目标序列完全配对的探针所形成的连接产物比在连接末端出现错配的产物，呈现出更高的 ΔCt 值。

图 3: HiFi Taq DNA 连接酶热稳定性更佳



HiFi Taq DNA 连接酶与 Ampligase (50 µl 体系中含1 µl 酶) 在其相应的1X 反应缓冲液中以80℃ 90s/94℃ 10s 的条件反应100个循环。连接酶活性测定：连接酶作用于FAM-标记的切刻 dsDNA 底物，产物经毛细管电泳分析。

图 4: HiFi Taq DNA 连接酶的错配率比 Ampligase 的错配率低2倍



当上游探针3´-末端及互补序列之间配对的碱基是 C:G时，连接反应相对困难，连接酶更难识别并防止错配连接的发生 (1)。

产品来源

纯化自重组的E. coli 菌株，携带有克隆自嗜热菌的连接酶基因。

所提供的试剂

随酶提供如下试剂：

应用

依赖于连接酶的等位基因检测，包括：连接酶检测反应 (LDR) 和连接酶链式反应 (LCR) (2、4)、连接锁式探针(5)等。

反应条件

1X HiFi Taq DNA 连接酶反应缓冲液

1X HiFi Taq DNA 连接酶反应缓冲液:
20 mM Tris-HCl
150 mM KCl
10 mM MgCl₂
10 mM DTT
1 mM NAD
0.1% Triton® X-100
pH 8.5 @ 25℃

贮存温度

-20℃

贮存条件

10 mM Tris-HCl
100 mM KCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
0.1% Triton® X-100
50% Glycerol
pH 7.4 @ -20℃

是否可以热失活

否 

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可单独购买

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1.      反应条件： HiFi Taq DNA 连接酶的反应温度为37–75℃。对于某组特定的探针，所使用的最适反应温度需选择在与探针 Tm 值相差 5℃ 以内。同时在实际应用中，需要根据经验平衡好活性和保真度。推荐使用 NEB的 Thermostable Ligase Reaction Temp Calculator 来计算最适反应温度。对于经典的 LDR 实验, 反应时间通常在10–60 min 之间，其中15 min 反应时间适用于多数实验。对于需要进行变性/退火/连接循环的实验，我们推荐的循环参数为：在最适反应温度下， 95℃ 反应30 s –1 min，退火/连接1 –5 min。

2.      1X HiFi Taq DNA 连接酶反应缓冲液需要 NAD⁺ 作为辅助因子。在随酶提供的10X HiFi Taq DNA 连接酶反应缓冲液中已经含有 NAD⁺。10X HiFi Taq DNA 连接缓冲液在 -20℃ 条件下可稳定保存3年，缓冲液可以保存到-70℃ 以延长 NAD⁺ 辅助因子的半衰期。

3.       HiFi Taq DNA 连接酶稀释后保存在 -20℃。可使用含50% 甘油的稀释保存液 (Diluent Buffer A, NEB #B8001)，稀释后的 HiFi Taq DNA 连接酶的质保期将缩短。如果稀释后立即使用，1X HiFi Taq DNA 连接酶反应缓冲液也可用于稀释。

4.      为使 HiFi Taq DNA 连接酶使用时达到最佳保真度，建议配合使用 HiFi Taq DNA 连接反应缓冲液。HiFi Taq DNA 连接酶在 Taq DNA 连接酶反应缓冲液中也可使用，此时酶的活性和保真度都将下降。相反的，如在 HiFi Taq DNA 连接酶反应缓冲液中使用标准 Taq DNA 连接酶将提升酶的保真度。HiFi Taq DNA 连接酶在多种聚合酶的缓冲液中都有活性，只需补加1 mM NAD，此时酶的活性和保真度都有所下降。

5.      在通过凝胶电泳来检测连接反应的结果时, 某些 DNA 序列由于结合了一些蛋白成分，可能发生凝胶迁移。这种蛋白结合作用不会影响包括扩增反应在内的绝大多数下游实验。我们建议在凝胶电泳上样之前，使用蛋白酶 K 进行预处理：50 μl 连接反应体系中加入1 μl 蛋白酶 K，37℃ 孵育30 min 以防止凝胶迁移。

6.      该酶的分子摩尔浓度为 44 nM。 

1.      Lohman, G. et al. (2016). Nucleic Acids Res. DOI: 0.1093/nar/gkv898, PubMedID: 44(2):e14

2.      Barany, F. (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 189-193.

3.      Takahashi, M. et al. (1984). J. Biol. Chem. 259, 10041-10047.

4.      Barany, F. (1991). The Ligase Chain Reaction in a PCR World. 5-16.

5.      Nilsson, M., H. Malmgren, M. Samiotaki, M. Kwiatkowski, B. P. Chowdhary and U. Landegren (1994). Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection.. Science. 265(5181), 2085-2088.