巯基氨基蛋白偶联树脂

特别提示：包括巯基氨基蛋白偶联树脂在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：巯基氨基蛋白偶联树脂
英文名称：SulfoLink Coupling Resin
产品货号：QN2655
产品规格：5ml|25ml

本品是一类预活化树脂，可以通过与巯基或者氨基的反应实现抗原的固定化，进而对免疫血清中的抗体进行纯化。

产品性能：
 

性能	指标
基质	4%琼脂糖微球
配体	*乙酸
载量	＞3mg
粒径(μm)	45-165
zuì大流速	0.1MPa
pH	稳定范围
储存缓冲液	1M NaCl

纯化流程

本树脂针对巯基和氨基的偶联条件有所差异，对于含有巯基抗原偶联请参考1.1流程，对于含有氨基抗原偶联请参考含氨基抗原偶联流程。

含巯基抗原的偶联流程：

1.缓冲液准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
偶联液：50mM Tris，5mM EDTA-Na，pH 8.5
封闭液：50mM Tris，5mM EDTA-Na，50mM L-半胱氨酸，pH8.5
保护液：20mM磷酸盐缓冲液，20%乙醇，pH8.0
结合/洗杂液：20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0
洗脱液：100mM甘氨酸，pH2.5-3.0
中和液：1M Tris-HCl，pH8.5

2.抗原准备
抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态（可以使用Ellman’s Reagent检测自由巯基的含量）。如果巯基已经氧化，必须对抗原进行还原，一般推荐使用还原剂TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine），TCEP溶液很稳定，可以选择性的、高效的打开抗原中的二硫键，并且不影响抗原与树脂的偶联反应，每毫克抗原中TCEP的添加量不超过12mg，需要自己进行优化。如果使用DTT等含有巯基的还原剂，处理完样品必须要将还原剂去除，否则会影响抗原与树脂的偶联效率。使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为1-3mg/ml的抗原溶液。建议该溶液现用现配，储存时间过长会影响偶联效果。

3.抗原偶联
1)取适量的本树脂，加入合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。
2)关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的抗原，混匀，取出至于合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
 注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
3)将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出。
 注：如有需要，可以使用Ellman’s Reagent检测其中巯基含量，得出抗原残留量，从而计算偶联效率。
4)关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
5)将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
 注：如果立即使用，可以参考1.1.4操作。如果以后使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于2℃-8℃保存。

4.抗体纯化
1)将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
2)将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1ml/min，并收集流出液。
3)用10～15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
4)使用5～10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
 注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0～8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
5)依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，zuì后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于2～8℃保存，防止填料被细菌污染。

含氨基抗原偶联流程：

1.缓冲液准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
偶联液：0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.5
封闭液：50mM Tris，5mM EDTA-Na，50mM L-半胱氨酸，pH8.5
保护液：20mM磷酸盐缓冲液，20%乙醇，pH8.0
结合/洗杂液：20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0
洗脱液：100mM甘氨酸，pH2.5-3.0
中和液：1M Tris-HCl，pH8.5

2.抗原准备
氨基是一种比较稳定的基团，所以，对于含有氨基的抗原没有太特殊的要求。使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为5-10 mg/ml的抗原溶液。

3.抗原偶联
1)取适量的本树脂，加入合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。
2)关闭柱子的下端出口，加入等体积的含氨基的抗原，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育3-5小时，或者2～8℃震荡孵育过夜（12-15小时）。
 注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
3)将上述反应体系取出，转移至重力柱中，其中的抗原溶液，并收集流出，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出，留待测试。
4)关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
5)将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
 注：如果立即使用，可以参考1.2.4操作。如果以后使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于2℃-8℃保存。

4.抗体纯化
1)将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
2)将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1ml/min，并收集流出液。
3)用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
4)使用5-10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
 注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
5)依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，zuì后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于2℃-8℃保存，防止填料被细菌污染。

SDS-PAGE检测：将纯化抗体样品得到的流出组分、洗杂组分和洗脱组分以及原始含抗体样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子流速低	筛板被堵塞	清洗或更换筛板
	样品或填料中有气泡	轻轻搅拌填料或敲击层析柱去除气泡
偶联液中蛋白或多肽沉淀	蛋白或多肽不溶	偶联液中加入小于30%的DMSO或DMF或6M盐酸胍促进样品溶解
偶联效率低	样品无巯基被氧化	加入DTT或TCEP后立即交联
洗脱组分纯度低	树脂没有彻底清洗	增加结合/洗杂液体积

除了巯基氨基蛋白偶联树脂,，我公司还供应以下相关产品：
 

货号	名称	规格
L0101	小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定ELISA试剂盒	96T×2
L0102	小鼠单抗ig类/亚类鉴定用酶标二抗即用套装	6X50ml
L0103	小鼠单抗ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装	6X100UL
L0201	小鼠IgA类单克隆抗体腹水纯化试剂盒	1盒
L0202	小鼠IgM类单克隆抗体腹水纯化试剂盒	1盒
L0204	小鼠IgG3类单克隆抗体腹水纯化试剂盒	1盒
CZ011	蛋白A/G磁珠抗体纯化试剂盒	1ml/5ml/25ml