丝状真菌线粒体DNAout

线粒体是重要的、负责能量产生的极其重要的细胞器。对丝状真菌线粒体进行生 化，遗传和分子生物学研究都需要先进行线粒体纯化。本产品就是基于密度梯度离心 的，专门用于从丝状真菌叶片中纯化完整线粒体、再从中纯化线粒体 DNA 的试剂盒。 它具有下列特点：
1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2. 所得线粒体可用于后续的 SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析、线粒 体 DNA 和线粒体 RNA 纯化。
3. 本产品足够 15 次线粒体纯化和 15 次线粒体 DNA 提取，每次可处理 10-20g 菌 丝体，能得到 1-5 mg 左右线粒体。
4. 已经成功用于 Aspergillus candidus、Aspergillus nidulans、Magnaporthe oryzae 、 Neurospora crassa 、 Penicillium chrysogenum 、 Rhizopus stononifer 等丝状真菌

使用方法 注意：纯化 DNA 提取用的线粒体的要求比纯化功能研究用的线粒体的要求要低，但 整个操作还是最好在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液最好在 4℃预冷，离心最 好要在 4℃进行，离心力以 g 而不是 rpm 计算。
一：菌丝的摇瓶培养
1. 使用合适的丝状真菌培养基，接种孢子至终浓度为 2×10E6/mL。一般 100 mL 液体培养基可以得到 0.8-1.2g 菌丝体，而本方法一次可以处理 10-20g 菌丝体， 故最好一次培养 1-2 升。
2. 在合适的温度（如 25℃、30℃或 37℃，根据真菌不同而不同）250rpm/min 摇晃培养 16-20 小时。
3. 用多层纱布或多层过滤纸过滤收集菌丝，用冰浴的自备去离子水洗涤菌丝三次去 除残留的培养基。
4. 用吸水纸吸干菌丝的水分，称重后立即使用。如果在-80℃或液氮长期放置，线 粒体回收效率将减低。 二：线粒体粗提液的制备
5. 制备溶液 A 工作液：每次提取需 150mL 溶液 A 工作液，制备方法是将 20mL 溶液 A 和 130mL 自备去离子水混合，冰上预冷即可。
6. 在 200mL 烧杯中，加入 100mL 预冷的溶液 A 工作液，再加入新制备的菌丝体， 然后全部转移到 Waring 匀浆机（家用果汁匀浆机）中，低速匀浆 10 秒，避免 起泡沫。用玻璃棒把菌丝按入匀浆机底部后，再低速匀浆 10 秒。注意：还可以 选择 Dounce 玻璃匀浆器，Polytron 匀浆机和研磨（加玻璃珠）等方法，但它 们单次处理量一般都较小，需多份处理再汇集。
7. 用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液，用预冷的 200 mL 量筒收集穿透液。
8. 将剩下的菌丝体转移到 Waring 匀浆机中，再加入 40 mL 预冷的溶液 A 工作液， 低速匀浆 10 秒，用上步的带柄尼龙滤膜过滤，用预冷的 200 mL 量筒收集穿透 液。注意：带柄尼龙滤膜后可反复使用。
9. 将穿透液分到 4 个预冷的 50 mL 的塑料离心管中（每个约 35 mL）。
10. 在水平转子离心机上 4℃ 4000 g 离心 10 分钟，小心转移上清（含线粒体的部 分）到 4 个新的离心管中。沉淀含细胞核和未裂解的细胞，可以弃之不用。如果 要用于纯化细胞核 DNA，则可以放-80℃长期保留。
11. 将含上清液的 4 个离心管在 4℃ 10000 g 离心 20 分钟。
12. 每个离心管中加 2.5mL 预冷的溶液 A 工作液重悬线粒体沉淀并汇集（共约 10 mL），此为线粒体粗提液。
13. 如果直接用线粒体粗提液提取线粒体 DNA，容易有细胞核 DNA 污染。具体步骤 是：在水平转子离心机上 4℃ 10000 g 离心 7 分钟，小心弃上清，沉淀为线粒 体，直接用于第三步的线粒体 DNA 提取。
14. 如果需要高纯度、无污染的线粒体 DNA，则需要用密度梯度离心法将完整的线 粒体和其他细胞碎片进一步分离。具体见下步线粒体精提液的制备。 三：线粒体精提液的制备（密度梯度离心法）
15. 制备重液和轻液：将 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 溶液 C 中，充分摇晃混匀 得 10 mL 重液。将 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 去离子水中，充分摇晃混匀 得 10mL 轻液。
16. 在 50 mL 塑料离心管中先加入 10 mL 重液，再在其上轻轻加上 10 mL 轻液， 最后加上第 11 步所得的约 10 mL 线粒体粗提液。
17. 加平衡离心管后在水平转子冷冻超速离心机上 4℃ 43000 g 离心 2 小时，重液 和轻液间的带为完整线粒体。
18. 用广口吸管小心将线粒体转移到新的离心管中，加入等倍体积的预冷的溶液 C， 轻柔混匀。取少量在相差显微镜下检查线粒体完整性。
19. 在水平转子离心机上 4℃ 19000 g 离心 20 分钟，小心将上清吸出后，线粒体沉 淀可以直接用于 DNA 提取。 四：线粒体 DNA 提取
20. 将 600 uL 通用线粒体 DNAout 溶液 A 加入到上步得到的线粒体沉淀中并吹打 混匀，然后转移到 1.5 mL 离心管中。
21. 65℃放置 5 分钟。
22. 加入 300 uL 通用线粒体 DNAout 溶液 B，震荡混匀 10-30 秒。注意：溶液 B 非常粘稠，可以将其预热到 65℃并剪掉一截枪头后再取。 23. 加入 200 uL 自备的氯仿，震荡混匀 10-30 秒。 24. 12,000 g 室温离心 3 分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。 25. 小心转移上清液（约 0.8 mL）到一个新的 1.5 mL 离心管中，避免触及中间层 的白膜，可留少量上清不取。 26. 加入 1 倍体积的自备，颠倒 30 次混匀。 27. 12,000 g 室温离心 5 分钟，小心弃上清液。 28. 在离心管中加入 1 mL 自备的 75%乙醇，震荡 30 秒。 29. 12,000 g 室温离心 1 分钟，小心弃上清液。 30. 12,000 g 室温离心半分钟，残留液体将汇集在管底。 31. 用洗液枪吸弃管底残留液（约 50 uL）。 32. 加 50-100 uL 自备的 TE 缓冲液，溶解 DNA 沉淀即得线粒体 DNA 溶液。直接 取 5-10 uL 电泳检测，其余放直接使用或放-80℃冰箱备用。