TUNEL检测阳性对照制备试剂盒

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专业生产销售TUNEL检测阳性对照制备试剂盒，我公司供应的细胞生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

TUNEL检测阳性对照制备试剂盒
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
编号：YT134
规格：10次

TUNEL检测阳性对照制备试剂盒可以用于TUNEL检测阳性对照的制备，制备后的阳性对照可以用于一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的荧光，也可以用于显色法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的显色检测。
DNase I可以剪切基因组DNA，使基因组DNA产生片段化(fragmentation)。基因组被片段化的细胞在用TUNEL法检查时会呈阳性染色。
本试剂盒足够制备10个阳性对照。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
需自备用于TUNEL检测的组织切片、或培养细胞的片子。需自备TUNEL检测试剂盒。

使用说明：
1. 参考TUNEL检测试剂盒的相关说明，把培养细胞或组织切片处理至进行荧光标记或生物素标记之前的一个步骤。
2. 用双蒸水或MilliQ级纯水稀释适量Reaction Buffer至1X。
3. 在样品上滴加50-100微升1X Reaction Buffer，室温孵育5分钟。
4. 离心沉淀DNase I。在100微升1X Reaction Buffer中精确加入1微升DNase I，混匀，滴加到样品上。
5. 室温(25℃)孵育10分钟。如果室温稍低于25℃，可以适当延长孵育时间；反之如果室温稍高于25℃，可以适当缩短孵育时间。
6. 用PBS或HBSS洗涤3次。
7. 随后参考TUNEL检测试剂盒进行荧光标记或生物素标记。
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·快速DNA连接试剂盒
编号：YT028
英文名称：Rapid DNA Ligation Kit
规格：100次|500次

快速DNA连接试剂盒是我公司研发的一种把DNA片段在短至5分钟内快速插入到载体(vector)中的连接试剂盒。对于双粘端DNA片段的插入仅需5分钟即可完成，对于双平端DNA片段的插入仅需15分钟即可完成。同时本试剂盒也可以用于其它各种常规的双链DNA连接反应。
本试剂盒可以用于PCR片段和载体的连接、酶切产物和载体的连接、linker和载体的连接、linker和linker的连接等各种双链DNA的连接。
为了获得快速高效的连接效果，本试剂盒采用了一种特殊的高活力DNA连接酶，即Rapid T4 DNAligase，确保在短时间内可以获得很好的连接效果。
为了方便后续连接产物转化细菌，我公司对本试剂盒的快速连接缓冲液进行了优化，在确保连接效果的同时，确保完成连接后不必进行任何纯化即可直接转化细菌。另外，快速连接缓冲液中已经含有ATP、镁离子等各种必需物质，无需再添加其它任何试剂。
本试剂盒用于总体积为10μl的连接体系时可以进行100个连接反应，用于总体积为20μl的连接体系时可以进行50个连接反应。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
连接反应完成后即可直接转化细菌，请勿采用加热方法失活Rapid T4 DNA ligase。加热处理会导致后续的转化效率显著下降。
对于载体单酶切插入外源片段的情况，需注意对载体进行脱磷处理，以避免质粒自连。

使用说明：
1. PCR产物或酶切片段和普通载体的连接：
a. 取1-2μg载体酶切过夜，或至少酶切3-5小时以上。尽量确保酶切充分，否则后续会导致产生很多自连的克隆。
b. 载体酶切完毕后，可以使用试剂盒进行纯化，例如PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于50-60bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。
c. 对于PCR产物：PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使用试剂盒进行操作，例如我公司的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA片段。
d. 对于回收的PCR产物或其它需酶切的质粒或DNA片段，用适当内切酶酶切，随后纯化酶切产物。注：这一步的酶切不必酶切特别充分，通常酶切效率能达到80-90%以上即可。即本步骤的酶切通常酶切1-2小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化，例如我公司的PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。
e. 取约25-100ng经过酶切和纯化的载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。注：很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。
载体 约25-50ng 约50-100ng
待插入片段 约载体摩尔数的3倍 约载体摩尔数的3倍
快速连接缓冲液(2X) 5μl 10μl
双蒸水或MilliQ水 至9.5μl 至19μl
Rapid T4 DNA ligase 0.5μl 1μl
总体积 10μl 20μl
f. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
g. 室温(25℃)孵育连接5-10分钟或更长时间。对于双平端连接需室温(25℃)孵育15-30分钟或更长时间。注1：对于双粘端连接：孵育5分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70-80%以上。孵育15分钟和孵育更长时间如60分钟等相比，无显著差异。连接5分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。注2：对于双平端连接：孵育15分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70-80%以上。孵育30分钟和孵育更长时间如60分钟等相比，无显著差异。连接15分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。注3：上述连接效率的数据在25℃时获得，在20-27℃时获得的连接效率比较接近。室温较低或较高时推荐在25℃水浴进行连接。
h. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
2. PCR产物和T载体的连接：
a. PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使用试剂盒进行操作，例如我公司的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA片段。
b. 按照T载体的说明书取适量T载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。注：很多时候由于载体量和PCR产物的量都比较少，在回收后很难定量。此时可以根据回收前电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算出最终得到的载体量和PCR产物的量的比例关系。
T载体 适量 适量
待插入片段 约载体摩尔数的3倍 约载体摩尔数的3倍
快速连接缓冲液(2X) 5μl 10μl
双蒸水或MilliQ水 至9.5μl 至19μl
Rapid T4 DNA ligase 0.5μl 1μl
总体积 10μl 20μl
c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d. 室温孵育5-10分钟或更长时间。
注：孵育5分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70-80%以上。孵育15分钟和孵育更长时间如60分钟等相比，无显著差异。连接5分钟后，如果转化等后续步骤还没有准备好，完全可以适当延长室温的连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟，可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
e. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
3. Linker或RNAi片段和载体的连接：
a. 载体的酶切和纯化同步骤1a和1b。
b. Linker或RNAi片段的退火可以选择适当的DNA退火缓冲液，例如我公司的Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251)， 进行退火反应。
c. 长度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和载体进行连接反应。例如载体为0.03pmol，则插入片段可以为0.15至0.3pmol。长度小于8bp的linker，比例需调整为10:1以上。
d. 除插入片段的用量外，随后按照步骤1e，1f，1g，和1h进行。
4. DNA自身环化的连接：
参考步骤1e，待插入片段换成适量的水即可。其余步骤按照步骤1f，1g，和1h进行。
5. 其它类型的DNA片段连接参考上述方法进行。
常见问题：
1. 连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少：
a. 可能感受态细菌转化效率太低，用质粒作为阳性对照同时检测感受态的转化效率。
b. 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。
c. 可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照。
d. 用存放DNA的溶液进行转化，作为阴性对照，检测感受态细菌是否存在问题。


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·Western半干法转膜液
编号：YT064
英文名称：Western Semi-dry Transfer Buffer
规格：10×1L

Western半干转法膜液可以用于Western时半干法电转膜。
本Western半干法转膜液是一种安全无毒的转膜液，没有使用剧毒的甲醇，也没有使用其它的有毒试剂。
配制Western 半干法转膜液的方法非常便捷，不需要调节pH值。
本Western转膜液共1瓶，可以配制1升Western半干转膜液。
保存条件：
室温保存，两年有效。
注意事项：
配制好的半干法转膜液可室温或4℃保存。配制好的半干法转膜液长期存放后，如果颜色变成浅棕色或黄褐色，应丢弃。
需使用分析纯级别的乙醇或纯度更高的乙醇。

使用说明：
1. 取一瓶可以配制1升Western转膜液的粉剂，倒入到一洁净的烧杯中，加入蒸馏水到约700毫升，溶解。
2. 再加入200毫升无水乙醇或210毫升95%乙醇，混匀。
3. 然后在量筒中用蒸馏水定容到1升。混匀后即可使用，无需调节pH值。没有用完的转膜液可室温或4℃保存，通常两周内使用没有任何问题。当转膜液颜色变为浅棕色或黄褐色时，应该丢弃。


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·核糖核酸酶A(100mg/ml)
编号：YT008
英文名称：RNase A
规格：0.5ml

用于消化RNA，进口分装，可直接使用。含微量DNase，在EDTA存在时，并且孵育温度不超过20℃时，检测不到很明显的DNase活性，可以用于质粒和基因组抽提等相关实验中去除RNA。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：


·细胞膜红色荧光探针
编号：YT173
英文名称：DiI
规格：10mg

DiI即DiIC18(3)，全称为1,1"-dioctadecyl-3,3,3",3"-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。DiI是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。
DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiI被激发后可以发出橙红色的荧光，DiI和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考下图。其中，最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm。
DiI的分子式为C59H97ClN2O4，分子量为933.88，CAS number为41085-99-8。
DiI可以溶解于无水乙醇、DMSO和DMF，溶解度约为1-2.5mg/ml。发现较难溶解时可以适当加热，并用超声处理以促进溶解。
DiI被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-term tracer)。DiI通常不会影响细胞的生存力(viability)。被DiI标记的神经细胞在体外培养的条件下可以存活长达4周，在体内可以长达一年。DiI在经过固定的神经元细胞膜上的迁移速率为0.2-0.6mm/day，在活的神经元细胞膜上的的迁移速率为6mm/day。
DiI除了最简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。
用于细胞膜荧光标记时，DiI的常用浓度为1-25μM，最常用的浓度为5-10μM。DiI可以直接染色活的细胞或组织，染色时间通常为5-20分钟。对于固定的细胞或组织，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。
保存条件：
4℃避光保存，一年有效。配制的储存液-20℃避光保存，半年有效。
注意事项：
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

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