小鼠白细胞介素12P70Mouse IL-12 p70 EL

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小鼠白细胞介素12P70Mouse IL-12 p70 ELISA KIT(48T/96T)
IL-12P70简介：
IL-12P70也称为自然杀伤细胞刺激因子（NKSF）或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(CLMF)主要是由受激发的巨噬细胞产生的多效性细胞因子。IL-12P70还可由树突状细胞、单核细胞、郎格罕细胞、嗜中性粒细胞和角化细胞等产生。
具生物学活性的小鼠IL-12P70是二硫键连接一个40 kDa (p40)和35 kDa (p35)的亚基的异型复合体，即70 kDa (p70)。成熟的小鼠40 kDa (p40)亚基有13个半胱氨酸和5个可糖基化的N末端的N313个氨基酸的蛋白。无论是p40 还是 p35亚基都不具有IL－12的生物学活性，但由两个p40亚基构成的同型复合物可与IL-12P70受体结合，从而充当IL-12P70的拮抗剂。虽然小鼠的IL-12P70对人和小鼠细胞都有活性，但人的IL-12P70只对人细胞有生物活性。
IL-12P70对T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞有多种作用，这些作用包括在T细胞和NK细胞中诱导干扰素和肿瘤坏死因子的生产，提高T细胞和NK细胞毒素的活性的以及刺激T细胞和NK细胞的分化。IL-12P70是IFN-γ的强烈诱导物，但诱导出的IFN-γ反过刺激吞噬细胞产生IL-12P70和其它促炎性因子，这样，由IL-12P70诱导的IFN-γ就在感染时促炎症反应中反馈放大的机理中扮演重要的角色。IL-12P70 在通过提高Th1细胞介导的免疫反应中有重要作用。

检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中小鼠IL-12P70的浓度。小鼠IL-12P70捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的小鼠IL-12P70会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗小鼠IL-12P70抗体后，抗小鼠IL-12P70抗体与小鼠IL-12P70接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IL-12P70将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，小鼠IL-12P70浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-12P70浓度。

小鼠IL-12P70定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分	规格（96T/48T）
小鼠IL-12P70预包被板	12条/6条
样本分析缓冲液	5ml/3ml
标准品稀释液	10ml/5ml
小鼠IL-12P70标准品	2支/1支(冻干)*
小鼠IL-12P70生物素化抗体	10ml/5ml
亲和素连接的HRP酶	10ml/5ml
浓缩洗涤液 20×	30ml/15ml
TMB底物	10ml/5ml
中止液	5ml/3ml
封板胶纸	3/2张
说明书	1份

操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于 4℃ 。
2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温(25～ 28℃ )孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。    
4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温(25～ 28℃ )孵育60分钟。  
6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温(25～ 28℃ )孵育20分钟。
8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温(25～ 28℃ )孵育20分钟。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD₄₅₀值。

结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
 

浓度pg/ml	典型OD值1	典型OD值2	OD平均值
0	0.1256	0.1071	0.1163
78.125	0.2528	0.234	0.2434
156.25	0.3057	0.3463	0.326
312.5	0.5621	0.5331	0.5476
625	0.9104	0.8384	0.8744
1250	1.4589	1.4183	1.4386
2500	2.233	2.0442	2.1386

灵敏度，特异性和重复性:
1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为11.2pg/ml。
2.特异性：与小鼠IL-12P70p35、IL-12P70p40monomer、IL-12P70p40dimer、IL-23，人IL-12P70、IL-12P70p35、 IL-12P70p40monomer和猫IL-12P70等没有交叉反应。
3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:
Gubler, U. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4143.
Trinchieri, G. (1995) Annu. Rev. Immunol. 13:251.
Windhagen, A. et al. (1996) J. Immunol. 157:1127.
Mehrotra, P.T. et al. (1998) J. Immunol. 160:2637.
D’Andrea, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1387.