cDNA第一链快速合成试剂盒（去除gDNA)

特别提示：包括cDNA第一链快速合成试剂盒（去除gDNA)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：cDNA第一链快速合成试剂盒（去除gDNA)
英文名称：QuickQuant RT Kit （with gDNase)
产品货号：WH0098
产品规格：25次|100次

本试剂盒是一种高效、快速并可以完全去除gDNA污染的反转录系统。本试剂盒所含的高效反转录酶QuickQuant RT Enzyme，42℃，15min即可完成cDNA第一链的合成，并具有与RNA模板高亲合性的特点，能通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。另外，本试剂盒含有高效去除gDNA的全新gDNase，42℃，3 min即可完全去除gDNA，有效避免Total RNA中gDNA的干扰，使qPCR结果更加准确可靠。

产品特点：
·快速：3 min完全去除gDNA。
·高效：15min反转录效率高达90%。
·简单：仅需2步主要操作。
·强力：42℃轻松通读高GC和复杂模板。

产品应用：
特别适合荧光定量RT-PCR检测；RT-PCR；cDNA文库构建；SAGE（基因表达连续分析）；引物延伸。

试剂盒组成：

组分	20μl×25次	20μl×100次
5×gDNA Buffer	50μl	200 μl
QQ-RT Primer Mix	50μl	200 μl
RT Enzyme Mix	25 μl	100 μl
10×Fast RT Buffer	50μl	200 μl
RNase- Free ddH2O	1ml	2×1ml

储存条件：-20℃可保存一年。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．下列操作步骤适用于模板量为50ng-2μg的总RNA，如果总RNA量大于2μg，请按比例扩大反应体系。
2．在冰上进行操作，防止RNA发生降解。
3．不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5min后迅速转移到冰上，进行下一步操作。
4．根据实验需求不同，也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量如下：Oligo-dT Primer 50pmol/20 μl反应体系，Gene Specific Primer 5 pmol/20 μl反应体系。
5．使用Gene Specific Primer时，反转录反应可设置为42℃，15min。当PCR反应有非特异性扩增时，将反转录温度升到50℃会有改善。
6．反转录体系可以根据需要相应扩大。

对RNA模板的要求：
逆转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA，模板RNA的质量和数量直接影响逆转录的结果。
1.模板的完整性：模板RNA的完整性对逆转录非常重要，若RNA模板中含有RNase酶将降解模板RNA，zuì后导致cDNA产物的量少甚至无cDNA产物。
2.模板的纯度：若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，将影响逆转录酶的活性，zuì后影响逆转录结果。
3.模板的加量：上述操作步骤适用于模板RNA量为50ng-2μg，如果模板RNA的量大于2μg，请按比例扩大反应体系。

操作步骤：
50ng-2μg总RNA可建立20 μl反应体系。

1．将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、QQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
  以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2．按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3 min。然后置于冰上放置。
  表1：gDNA去除反应体系

加入物	使用量
5×gDNA Buffer	2 μl
Total RNA
RNase-Free ddH2O	补足到10 μl

3．按照表2的反转录反应体系配制混合液。
  表2：反转录反应体系

加入物	使用量
10×Fast RT Buffer	2 μl
RT Enzyme Mix	1 μl
QQ-RT Primer Mix	2 μl
RNase-Free ddH2O	补足到10 μl

4．将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。
5．42℃，孵育15min。
6．95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

注意：
1．若后续实验为实时荧光定量PCR，逆转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10，例如50μl的PCR反应体系，逆转录产物的加量应不超过5 μl。
2．将逆转录产物置于冰上，再进行后续PCR反应；如果需要长时间保存，请置于-20℃。

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