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概述
该载体系统设计用于利用piggyBac转座子系统有效分析小鼠模型中的哺乳动物启动子。通常,将假定的目标启动子克隆到该载体中,在LacZ报告基因的上游,所得构建体用于制造转基因小鼠。然后,可以将LacZ报告基因在转基因胚胎或成年小鼠中的表达用作启动子活性的读数。该载体系统可用于鉴定启动子元件、确定启动子的组织特异性、比较启动子变体、谱系追踪和许多其他应用。
我们基于piggyBac转座子的载体系统对于将外源DNA插入哺乳动物细胞的宿主基因组非常有效。该系统在技术上很简单,利用质粒(而不是病毒转导)将您感兴趣的基因永久整合到宿主基因组中。
piggyBac系统包含两个载体,均被设计为大肠杆菌质粒。一种载体,称为辅助质粒,编码转座酶。另一种载体称为转座子质粒,包含两个倒置末端重复序列(ITR),包围要转座的区域。将感兴趣的启动子序列克隆到该区域。当辅助质粒和转座子质粒共进样或共转染到靶细胞中时,辅助质粒产生的转座酶将识别转座子上的两个ITR,并将包括两个ITR在内的侧翼区域插入宿主基因组。插入通常发生在包含 TTAA 序列的宿主染色体位点,该序列在转位后在整合片段的两侧复制。
PiggyBac是II类转座子,这意味着它以剪切和粘贴的方式移动,从一个地方跳到另一个地方而不会留下副本。(相比之下,I 类转座子以复制和粘贴的方式移动。由于辅助质粒只是短暂地引入宿主细胞,因此它会随着时间的推移而丢失。随着辅助质粒的丢失,转座子在宿主细胞基因组中的整合成为永久性的。
亮点
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我们的载体基于piggyBac转座子系统。要测试的推定启动子被放置在LacZ报告基因的上游。虽然活性启动子会驱动下游LacZ基因的表达,但在没有启动子活性的情况下,LacZ表达很少或没有。使用LacZ作为报告基因,因为在整个安装胚胎或组织切片中通过X-gal对LacZ进行比色染色,可以高度灵敏地原位检测启动子活性。
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优势
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简单灵敏的读数:当使用LacZ作为报告基因时,X-gal染色会产生鲜艳的蓝色产物,即使在低表达水平下也很容易检测到,从而非常灵敏地读取启动子活性。
易产生转基因动物:该构建体可以很容易地用于通过常规原核注射高效产生转基因胚胎或活小鼠。
技术简单: 通过常规转染或注射将质粒载体递送到细胞中在技术上很简单,并且比需要包装活病毒的基于病毒的载体容易得多。
载体DNA的永久整合: 使用常规质粒导致DNA几乎完全瞬时递送到宿主细胞中,因为DNA会随着时间的推移而丢失。这个问题在快速分裂的细胞中尤为突出。相比之下,由于转座子整合到宿主基因组中,转染或注射piggyBac转座子质粒和辅助质粒可以将转座子上携带的DNA序列永久递送到宿主细胞中,从而可以进行长期观察。
非常大的载货空间:我们的转座子载体可以容纳~30 kb的总DNA。这允许测试大的假定启动子序列。
不足之处
需要辅助质粒: 与常规质粒启动子检测载体不同,piggyBac载体系统需要使用两个质粒,一个辅助质粒和一个转座子质粒。为了有效地将启动子序列插入宿主基因组,两个质粒必须存在于相同的细胞中。
载体关键元件
5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.
Promoter: Your promoter of interest is placed here.
LacZ: The beta-galactosidase reporter gene. The encoded enzyme converts the colorless and soluble X-gal to an intensely blue insoluble product that stains the cells in which LacZ is expressed.
SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
3' ITR: 3' inverted terminal repeat.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.