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Tol2 FLEX 条件基因表达载体(Cre-Off)
概述
Tol2 FLEX条件性Cre-Off基因表达载体将VectorBuilder的高效Tol2载体系统与Cre响应性FLEX条件基因表达系统相结合,帮助您实现转染介导的Cre响应性FLEX开关与宿主基因组的永久整合。FLEX Cre-Off开关利用两对LoxP变异重组位点,这些位点位于目的基因的排列两侧,通过编码序列的Cre依赖性反转促进基因表达的稳健失活。
FLEX Cre-Off开关由两对异型LoxP变异重组位点组成,即具有野生型序列的LoxP和具有突变序列的Lox2272,位于ORF的两侧。Cre可以识别这两种LoxP变体,但只有相同的LoxP位点对才能相互重新组合,而不能与任何其他变体重新组合。LoxP 和 Lox2272 位点以交替方式组织,每对具有反平行方向。在没有Cre重组酶的情况下,ORF可以在用户选择的启动子的控制下表达。在Cre存在的情况下,LoxP和Lox2272位点分别与其他LoxP和Lox2272位点进行重组,导致ORF反转为反义取向,并从每对相同的重组位点中切除一个。ORF的反转阻止了目的基因的表达。由于ORF现在两侧有两个不同的LoxP变体位点,即使存在Cre也不会发生进一步的重组事件。
Tol2载体系统在技术上很简单,利用质粒转染(而不是病毒转导)将感兴趣的基因永久整合到宿主基因组中。Tol2 FLEX条件Cre-Off基因表达载体系统包含两种载体,均被工程化为大肠杆菌质粒。一种载体,称为辅助质粒,编码转座酶。另一种载体称为转座子质粒,包含两个末端重复序列(TRs),包围着要转座的区域。上述 FLEX 创建关闭开关被克隆到此区域中。
当转座子和辅助质粒共转染到靶细胞中时,辅助质粒产生的转座酶将识别转座子上的两个ITR,并将侧翼的FLEX Cre-Off开关(包括两个ITR)插入宿主基因组。插入在插入部位序列方面没有任何明显的偏倚。这与具有特定目标共识位点的转座子系统不同。例如,piggyBac转座子通常在包含序列TTAA的位点插入。然后,在Cre介导的编码序列反转时,可以在Cre重组酶存在下灭活基因表达。
虽然该载体系统可用于组织培养细胞,但它特别适用于转基因动物的产生。当携带这种载体的转基因动物与携带组织特异性Cre转基因的动物杂交时,目的基因将在携带两种转基因的后代动物中被关闭,特别是在表达组织特异性Cre的细胞中,并且用户选择的驱动目的基因的启动子是活跃的。
Tol2 是 II 类转座子,这意味着它以剪切和粘贴的方式移动,从一个地方跳到另一个地方而不会留下副本。(相比之下,I 类转座子以复制和粘贴的方式移动。Tol2 通过剪切和粘贴机制作为单个副本集成。在每个插入位点,Tol2转座酶产生8 bp重复,导致基因组中每个转座子整合位点两侧相同的8 bp直接重复。
亮点
Tol2 FLEX条件性Cre-Off基因表达载体旨在实现Cre介导的哺乳动物细胞和动物基因表达的条件抑制。目的基因的表达最初在用户选择的启动子的控制下,并且可以通过Cre重组酶的共表达永久沉默,这将目的基因反转为其反义方向。
该载体与编码 Tol2 转座酶的辅助质粒一起经过优化,可在大肠杆菌中进行高拷贝数复制、高效转染到各种靶细胞中,以及载体上携带的转基因的高水平表达。
优势
开关样基因失活:在Cre重组酶存在下,将用户选择的ORF反转为其反义方向可防止任何泄漏的基因表达。
稳定的基因失活:用Cre重组酶处理将用户选择的ORF永久反转为其反义方向。当ORF反转为其反义方向,然后通过重组从每对相似的LoxP位点中切除一个位点时,ORF的两侧将是两个不同的LoxP变体位点,即使存在Cre,这也将防止进一步的重组事件。这将永久阻止目的基因的转录。
载体DNA的永久整合: 传统转染导致DNA几乎完全瞬时递送到宿主细胞中,因为DNA会随着时间的推移而丢失。这个问题在快速分裂的细胞中尤为突出。相反,由于转座子整合到宿主基因组中,将哺乳动物细胞与Tol2转座子质粒和辅助质粒一起转染可以将转座子上携带的基因永久递送到宿主细胞中。
技术简单:通过传统转染将质粒载体递送到细胞中在技术上很简单,并且比需要包装活病毒的基于病毒的载体容易得多。
非常大的载货空间:我们的 Tol2 FLEX 条件 Cre-Off 基因表达载体可以容纳 ~11 kb 的总 DNA。质粒骨架、转座子相关序列和Cre介导重组所需的序列仅占约3.1 kb,留出足够的空间来容纳用户感兴趣的序列。
不足之处
有限的细胞类型范围:Tol2载体递送到细胞中依赖于转染。转染效率因细胞类型而异。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞通常比永生化细胞系更难转染。众所周知,一些重要的细胞类型,如神经元和胰β细胞,很难转染。这些问题限制了 Tol2 系统的使用。
载体关键元件
5' ITR: Tol2 5' terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the Tol2 transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.
Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.
Lox2272: Recombination site for Cre recombinase. Mutated Lox site with two base substitutions of wild type LoxP. Incompatible with LoxP sites. When Cre is present, the LoxP and LoxP2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.
LoxP: Recombination site for Cre recombinase. Incompatible with Lox2272 sites. When Cre is present, the LoxP and Lox2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.
Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.
ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here, in a sense orientation.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
3' ITR: Tol2 3' terminal repeat.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.