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- xuanya
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- XY-TE-0588
- 2025年11月06日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
常温运输和保存
- 保质期：
两年
- 英文名：
Random Primer DNA Labeling Kit
- 库存：
890
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在KlenowDNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：
随机引物法DNA探针标记试剂盒本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良，具有下列特点：
1.提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2.使用无外切活性的Klenowexo-DNA聚合酶，已标记DNA探针不会被酶降解。
3.快速，最快1小时即可完成标记反应。
4.得到的DNA探针比活性高（如果是同位素，可以达到109cpm/ugDNA）。
5.所需模版DNA量少，可以是各种形状（线状和环状）的、也可以是单链或双链的，但长度必须在100bp以上。
6.得到的探针长度在200-400nt之间，可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
7.提供三种标记选择，其中A可用于各种同位素和非同位素标记，但需自备标记底物；B和C可分别用于生物素和标记，不需自备标记底物。
随机引物法DNA探针标记试剂盒运输及保存：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：0.5MEDTA（pH8.0）。如果是A型，则需要自备标记的核苷酸。
随机引物法DNA探针标记试剂盒使用方法
1.在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
成分 用量
模板DNA 50-150ng
2×随机引物标记反应液(ABC三种之一) 10uL
超纯水 补水到15uL
随机引物法DNA探针标记试剂盒注意：非同位素标记基团疏水性强，易与塑料离心管表面非特异性结合，所以要硅化塑料离心管。模板DNA并非越多越好，否则会竞争性地抑制探针跟靶分子的杂交。
2.沸水浴5-10分钟，或在PCR仪上100℃加热5-10分钟后立即放冰上待用。
3.高速离心数秒使所有液体集中在管底，根据试剂盒类型加入下列成份：
试剂盒类型 成分及用量
A型 dATP、dGTP、dCTP各1uL（共3uL，浓度均为2mM）自备的2mMdTTP/标记dUTP混合物（见注）1uL 1uLKlenowexo聚合酶
B型 1uLKlenowexo聚合酶 4uL超纯水 不需加dNTP，已经包括在2×随机引物标记反应液（B型）中
C型 1uLKlenowexo聚合酶 4uL超纯水 不需加dNTP，已经包括在2×随机引物标记反应液（C型）中
随机引物法DNA探针标记试剂盒注：上表中的dTTP/标记dUTP混合物中dTTP和标记的dUTP的总浓度为2mM，dTTP与标记dUTP的比例在65：35为最佳。但如果使用自备的其他标记核苷酸，如fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin和aminoallyl标记的dUTP，则用户需要自己摸索其与dTTP之间的最佳比例，如果使用32P标记的dUTP，则比活最好为3000Ci/mmol，浓度为好为10uCi/uL，并且不需要加入dTTP。
4.轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，高速离心数秒使所有液体集中在管底。
5.37℃保温1-20小时。标记效率跟模板量和保温时间相关，具体见下表：
6.加1uL自备的0.5MEDTA（pH8.0）终止反应，加热100℃5分钟使DNA探针变性成单链，然后直接加入到杂交反应液中即可。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。立即放冰上待用或放-20℃保存一年。用前需要
随机引物法DNA探针标记试剂盒注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，注意不要用酚抽提法纯化非同位素标记的DNA探针，因为这些标记分子疏水性强，能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失，但可以用乙醇沉淀和SephadexG50回收（可另购柱式探针纯化试剂盒）。对比活高的同位素标记探针，由于同位素其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。
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文献和实验随机引物法探针标记 随机引物法的原理是使被称为随机引物(random primer)的长6个核苷酸的寡核苷酸片段与单链DNA或变性的双链DNA随机互补结合(退火)，以提供3， 羟基端，在无5， →3， 外切酶活性的DNA聚合酶大片段(如Klenow片段)作用下，在引物的3， 羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物。当反应液中含有标记的核苷酸时，即形成标记的DNA探针。6个核苷酸混合物出现所有可能结合序列，引物与模板的结合以一种随机的方式发生，标记均匀跨越DNA全长。当以RNA
缺口平移法探针标记 探针的标记方法很多，大致可以分为两大类：引入法和化学修饰法。引入法是运用标记好的核苷酸来合成探针，即先将标记物与核苷酸结合，然后通过DNA聚合酶、RNA聚合酶及末端转移酶等将标记的核苷酸整合入DNA或RNA探针序列中去。化学修饰法即采用化学方法将标记物掺入已合成的探针分子中去，或改变探针原有的结构，使之产生特定的化学基团。引人法较化学修饰法更常用．按其整合的方法不同?引入法可分为缺口平移法、随机引物法、末端标记法和PCR扩增标记法和RNA体外转录法等。 缺口
非常高，一般情况下同位素是首选。如今Atlas SpotLight标记试剂盒特别提供逆转录所需的试剂，可以将2μg以上的mRNA或者50μg以上的RNA样品制备成生物素标记的单链cDNA探针，由于没有竞争性抑制，单链探针的灵敏度要大大高于双链探针。另外生物素标记的探针比32P标记的探针要稳定，可以在半年内多次重复使用。 对于Southern、Northern和多组织Northern预制杂交膜（MTN）、多组织表达矩阵（MTE）等以尼龙膜为基质的杂交、印迹反应，可以选用SpotLight随机引物标记试剂盒
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