细胞器DNA提取

细胞器DNA提取产品及特点：
线粒体DNA（mtDNA）是进行分子进化研究和母性遗传研究的重要材料，但传统的两步式mtDNA提取方法是先温和裂解细胞，分离线粒体，然后再从线粒体中提取mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制，需要针对不同组织材料单独进行优化。本方法克服了上述缺点，具有下列优点：
1.不需要单独纯化线粒体，柱式法纯化，操作简单快捷。
2.得到的mtDNA可以直接用于PCR。
3.每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3-5ugmtDNA。
4.注意：本产品只适合于动物材料，不适合于植物材料，因为植物线粒体DNA一般都十分巨大，非常难提。

细胞器DNA提取运输及保存：
常温运输，短期可以在室温放置；长期保存最好放4℃。
自备试剂：无

细胞器DNA提取使用方法
一：培养细胞预处理
1.用自备的0.25%胰酶消化液处理约107个培养细胞，离心收集后弃上清。
2.用PBS或TBS等缓冲液洗涤细胞两次，离心得到的细胞沉淀直接用于mtDNA提取。

细胞器DNA提取二：组织细胞预处理
3.用剪刀将1g新鲜的动物组织剪碎（芝麻大小最好），转移到1.5mL塑料离心管中，用于mtDNA提取。
注意：最好不要使用冻存的动物组织，因为冻凝过程中形成的冰晶会将线粒体刺破，使其DNA释放出来被胞浆中的DNA酶降解，影响回收率。

细胞器DNA提取三：血液预处理
4.将3-5mL抗凝外周血静置30分钟或低速离心5分钟，取白细胞层。
5.用自备PBS洗涤白细胞两次，得到的白细胞沉淀用于mtDNA提取。

细胞器DNA提取四：mtDNA提取
5.在细胞沉淀或剪碎的组织中加入250uL冰浴的溶液A，充分吹打分散。如果是剪碎的组织，不要等成块的组织溶解即可继续下步操作。
6.加入250uL常温的溶液B（如果溶液B有沉淀，用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和反复颠倒混匀10次。千万不要剧烈振荡。
7.冰上放置6-8分钟。注意不要超过8分钟。
8.加入350uL冰浴的溶液C，温和混匀4-6次，可见白色沉淀物产生，然后放冰上放置20-25分钟。
9.室温12000-15000g离心10分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，有时候出现沉淀漂浮是正常现象，取上清时避开漂浮的沉淀即可。
10.静置5分钟以让DNA与离心吸附柱充分结合，此步十分重要。
11.室温12000-15000g离心1分钟，弃收集管中的废液。
12.加入500uL的通用洗柱液，室温12000-15000g离心1分钟，弃收集管中废液。
细胞器DNA提取注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。
13.重复上步1次。
14.室温12000-15000g离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA的后续使用（如DNA上样时不能沉淀到加样孔中）。
15.将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管中，加入30-50uL65-80℃预热的DNA洗脱液，室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液也可以用于洗脱，但产量稍微有所降低。
16.室温12000-15000g离心1分钟，离心管底溶液即mtDNA。
17.由于本公司离心吸附柱结合DNA能力较强，如果再加30-50uLDNA洗脱液到离心吸附柱中，往往还能洗脱下很多mtDNA（相当于第一次洗脱的20-30%），但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液来洗脱。
18.12000-15000g离心1分钟，离心管底溶液即线粒体DNA。每107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克组织一般能得到3-5ugmtDNA。如果DNA需要浓缩，可以使用本公司的核酸浓缩剂。
19.由于DNA机械断裂，电泳时DNA可能不呈现专一的带，但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。

人mtDNA只有D环区(D-loop，参与复制启动)和另外87个bp不是编码基因外，其余序列共编码13个蛋白质（细胞色素b、细胞色素氧化酶的3个亚基、ATP酶的2个亚基以及NADH脱氢酶的7个亚基）、24个rRNA（包括1个16SrRNA、1个12SrRNA和22个tRNA）。人类的神经肌肉变性疾病如Leber氏遗传性视神经病、帕金森病、早老痴呆症、线粒体脑肌病、母系遗传的糖尿病和耳聋等都同线粒体基因有关。
与细胞核DNA相比，mtDNA具有下列特点：
①突变率高，是核DNA的10-100倍左右，有利于检查出在较短时期内基因发生的变化，有利于比较不同物种的相同基因之间的差别，确定这些物种在进化上的亲缘关系；
②母性遗传(maternalinheritance)，这是由于动物精子的细胞质极少，子代mtDNA基本上都是来自卵细胞，因此具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先。
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