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- xuanya
- 中国/美国
- XY-TE-0028
- 2025年09月22日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
常温运输和保存
- 保质期：
两年
- 英文名：
FFPE RNAOUT
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
石蜡包埋组织本是珍贵的分子生物学研究材料，但是由于它们的保存时间一般都比较长，很不容易从中提取到可以进行PCR的RNA，存在的主要问题是RNA的降解和脱蜡过程中样品的丢失。
免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒本产品是专门用于从甲醛和非甲醛固定的石蜡包埋组织中快提RNA的试剂，具有下列特点：
1. 一管式操作，避免了可能的交叉污染和样品RNA的丢失。
2. 含一步离心式脱蜡试剂，不需要使用有毒的二甲苯，健康环保。
3. 能有效去除基因组 DNA 的污染，得到的RNA可直接用于 RT-PCR 反应。
4. 即开即用，客户自己不需要准备额外的试剂。
免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒运输及保存：
低温运输，4℃保存（溶液 C 需要-20℃放置），有效期一年。
自备试剂：氯仿、75%乙醇。
免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒使用方法
1. 将 5 片厚度为 6-8 um 的石蜡包埋组织切片转移到 1.5 mL 塑料离心管(最好 使用螺旋盖离心管)中并加入 1 mL 溶液 A，在振荡器上以最大速度振荡 10 秒。
2. 加入 75 uL 溶液 B，在振荡器上以最大速度振荡 10 秒。
3. 7000×g 室温离心 2 分钟，溶液将形成两个相，其中组织切片位于下相。
4. 小心吸弃上层液体。
5. 将离心管放入真空抽干机中抽干下层的液体，一般需要一小时。
6. 加入 150 uL 溶液 C，55℃保温过夜。
7. 短暂离心，95℃保温 10 分钟。
8. 加入 0.5 mL 溶液 D，充分震荡半分钟。
9. 加入 0.1 mL 自备氯仿，振荡器上充分振荡混均 30 秒。
10. 13000-5000×g 室温离心 3-5 分钟。
11. 将上清液（约 0.6 mL）转移到另一干净的 1.5 mL 塑料离心管中。下层有机 相（蓝色）和中间层含有 DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和 DNA 污染。为保险起见，可以留下 100 uL 上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢 进行，否则容易吸出交界面的不可见的 DNA。
12. 在上清液中加入两倍体积的微量核酸沉淀剂，振荡器上振荡 30 秒混匀。
13. 13000-15000 g 室温离心 5 分钟，离心底的侧面将形成 RNA 沉淀。如果需 要提高 RNA 回收率，可以将离心时间延长到 20 或 30 分钟。
14. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。
15. 在含 RNA 沉淀的离心管中加入 1mL 自备的 75%乙醇，振荡混匀 30 秒。
16. 13000-15000 g 室温离心 1 分钟。
17. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。
18. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留乙醇(约 50 uL)。注意不要吸弃沉淀。 此步十分重要，否则残留的乙醇会影响 RNA 的使用。
19. 室温放 1-2 分钟后立即加入 50-100 uL RNA 溶解液使 RNA 沉淀溶解。千万 不要用真空离心法使 RNA 沉淀过于干燥，否则 RNA 将变得十分难溶。样品立 即使用或存放于-80℃待用。
20. RNA 完整性的电泳检测：
21. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检 测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度×体积)和产率(RNA 产量/ 组织用量)。
22. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。
免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒背景资料：甲醛固定组织细胞的分子机制--蛋白质部分
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文献和实验随机引物 适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。 Oligo dT 适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具PolyA 尾 巴。）由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。 基因特异性引物 与模板序列互补
定量RT-PCR （Quantitative RT-PCR）
A = B(1+e) n A=amplified products, B=input templates, n=cycle number, and e=amplification efficiency. Factors affecting amplification efficiency in the RT-PCR process include the efficiency of reverse
性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A.变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C.延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2＋存在下，退火引物沿 5‘ —— 3’ 方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3. 逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性： (1)依赖 RNA
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