T7 RNA聚合酶

特别提示：包括T7 RNA聚合酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：T7 RNA聚合酶
英文名称：T7 RNA Polymerase
产品货号：JN0010
产品规格：5000U

  本酶是噬菌体T7 DNA 编码的酶，以含有T7 启动子序列的双链DNA 为模板，以NTP 为底物，合成与启动子下游的单链DNA 互补的RNA。本酶对T7 启动子序列具有高度特异性，不能识别其它生物来源的启动子。

产品组成：

组份	JN0010-5000U
T7 RNA Polymerase（20U/μl）	250μl
5×Transcription Buffer	1ml×2

活性定义：在37℃、pH8.0 的条件下，1小时内使1nmol的 [3H] GMP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。

产品用途：
1、合成单链RNA；
2、合成高特异性RNA探针；
3、合成siRNA前体；
4、制作RNA剪接反应（RNA splicing）的前体；
5、以帽类似物（Cap analog）为引物，制作Capped mRNA。

使用建议：
1、为了特定区域的有效转录，建议在其区域下游把模板DNA 预先切成平端或5′突出末端。
2、缓冲液中的亚精胺与核酸结合可能形成不溶物，建议zuì后加入模板DNA。

常用反应体系（50μl）：

组分	体积
5X Transcription buffer	10μl
ATP/GTP/CTP/UTP Mix,	10μl
10 mM each	(终浓度为2 mM )
线性化的模板DNA	1μg
RNase Inhibitor（40U/μl）	1.25μl
T7 RNA Polymerase（20U/μl）	1.5μl
DEPC 水	补足到50μl
37℃反应2 小时。

质量保证：经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带；PCR方法检测无大肠杆菌DN A残留，无RNA聚合酶，无DNase和RNase污染。

除了T7 RNA聚合酶,，我公司还供应以下相关产品：



名称：dNTP溶液(10mM)
货号：BTN51208B
规格：0.5mL
本产品是dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种核苷酸的混合液，每种核苷酸的浓度为10mM，纯度在98%以上(HPLC检测)，不含DNA内切酶、DNA外切酶、RNA酶和磷酸酶的污染，可以直接用于PCR、RT-PCR、cDNA合成、DNA测序、DNA探针标记等反应。使用浓度根据具体的反应决定，请参考相关手册。



储存条件：低温运输和-20℃保存、有效期一年。

DNA为何使用2"-脱氧核糖和胸腺嘧啶？
 DNA为何不选择现成的光合作用产物核糖和合成RNA的原料尿嘧啶(uracil)分别作为其糖分子和碱基，而去选择需要额外的合成步骤才能得到的2"-脱氧核糖和胸腺嘧啶(thymine)，其原因何在呢？目前的主流观点是：DNA不能选择核糖的原因之一是由于核糖2"位置上的OH基团会使得到的双螺旋骨架结构不均匀、不平行，难以有效地折叠进染色体结构中，而使用2"-脱氧核糖则能得到均匀平行的双螺旋结构；原因之二是核糖2"位置上的OH基团会对邻近的磷酸二酯键进行分子内亲核攻击，降低分子的稳定性，而对遗传物质来说稳定性十分重要，所以DNA选择了失去分子内亲核攻击能力的2"-脱氧核糖。对信使分子而言，稳定性并不重要，所以RNA仍然使用核糖。
 DNA使用胸腺嘧啶的原因是DNA中的胞嘧啶(cytosine)会缓慢水解变成尿嘧啶，如果尿嘧啶也是DNA的正常组成成份，则DNA修复系统就不能区分哪些尿嘧啶是正常的，哪些是需要修复的。使用胸腺嘧啶(比尿嘧啶分子多一个甲基)不但能保持跟尿嘧啶一样的形成碱基对的能力，同时又能跟尿嘧啶区别开来，使DNA分子中出现的任何尿嘧啶都能被尿嘧啶DNA糖苷酶(uracil-DNA glycosylase)发现和修复。

名称：T7体外转录试剂盒
货号：BTN91106
规格：50次
本试剂盒是基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T7启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的zuì佳长度在20nt到2000nt之间。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模版可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T7 RNA聚合酶	50μL
RNase-free水	1mL
说明书	1份

储存条件：-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一、制备DNA模板(本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考)

PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2)是需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子一、制备DNA模板(本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考)

PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。
1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2)需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
3)需要转录的DNA序列的下游端zuì好不要是3′突出。如果是3′突出(比如选择了Pst I来线性化质粒)，则zuì好用T4 DNA聚合酶修平。
4)必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，zuì好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板		如果使用质粒DNA,必须反复酚-氯*抽提去除残留的RNase,然后再乙醇沉淀质粒DNA需室温时使用
PCR片段	50ng左右
质粒DNA	1μg左右
阳性对照	4μL
转录预配液，2×	10μL
T7 RNA聚合酶	1μL
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶。
4. 取1-3μl电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

三、去除DNA模板(所需试剂可从本公司另购)
1.在体外转录体系中加入1μL自备的RNase-free DNase(3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL。
4. 用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-氯*抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5. 加自备的200μL微量核酸沉淀剂(用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

疑难解答：
1、没有RNA产物。zuì常见原因是模板有RNase污染，可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。zuì常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基zuì好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6启动子)。
4、RNA长度比预计的长。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，zuì多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5、5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。