Protein A 蛋白纯化

Protein A 抗体纯化柱使用说明
【产品说明】
本产品使用Protein A抗体结合结构域融合后的重组蛋白和4％浓度的琼脂糖树脂偶联制成。由于采用了重组表达的Protein A，并去除了其白蛋白结合区，该基质能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段，作为亲和树脂，可用来纯化不同来源的抗体和抗体亚型，以及在免疫共沉实验中捕获免疫复合物。本产品使用了多位点交联技术，稳定性好、特异性高并具有广谱结合力，每ml基质可特异性结合约6 毫克抗体。
【产品组分】
50％Protein A -Agarose悬液，PBS，20％乙醇
【储存条件】
4℃保存，有效期一年；常温（15~25℃）运输；切勿冻结！
【抗体纯化】
1) 取适量Protein A -Agarose悬液，装入层析柱，用10倍柱体积的PBS（或者TBS，下同）洗涤平衡层析柱。
2) 含抗体的血清或其它体液高速离心后，将上清与等体积2×PBS缓冲液混合，调整pH以及离子浓度后，缓慢加入层析柱。
3) 用10倍柱体积以上的PBS洗涤，至流出液无蛋白检出。
4) 加入2倍柱体积0.1 M 柠檬酸（Citrate Acid, pH 2.7），夹住流出管，静置5分钟后收集穿出液，重复三次。测定OD₂₈₀估算抗体浓度，如果所得抗体较多可以使用SDS-PAGE检测纯度。也可以选择0.1 M甘氨酸（Glycine, pH 3.0）洗脱。
5) 洗脱后的抗体加入2/5体积的1 M Tris，pH 8.0中和，使用Millipore蛋白浓缩管切换到所需缓冲液，通常为2×PBS含有0.02% NaN₃以及1 mM EDTA。
6) 浓缩到所需体积，加入50%甘油；测定效价后，分装并保存在-20℃，避免冻结。
【树脂处理】
1) 层析柱中Protein A Bead使用后需要及时处理，酸洗脱抗体以后，使用10倍柱体积PBS洗柱平衡到中性，20%乙醇溶液充分洗涤后，封闭上下两端，保存在4℃。
2) 如果样品较粘稠，造成层析柱筛板堵塞，可使用含有1% Triton-100的PBS浸泡1-2小时，再切换到20%乙醇溶液中，两端封闭前，灌满20%乙醇溶液，避免柱子干缩。
【注意事项】
抗体纯化柱可以多次反复使用，但应当避免同一根纯化柱纯化不同的抗体，因为抗体和Protein A 之间结合紧密，酸洗脱并不能完全洗去目标抗体，将产生交叉反应。