一管式反转录试剂

特别提示：包括一管式反转录试剂在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一管式反转录试剂
英文名称：QuickQuant RT Super Mix
产品货号：WH0100
产品规格：25次|100次

本制品为一管式预混Mix，使得cDNA的合成更加的方便快捷。4×QQ-RT Super Mix中含有RT-PCR中反转录反应所需的所有试剂（QuickQuant RT Enzyme、RNase Inhibitor、Randomprimers、Oligo dT primer、dNTP Mixture、反应Buffer），加入模板RNA和RNase-Free ddH2O即可进行反应。本产品使用高效反转录酶QuickQuant RT Enzyme，可以在较短时间内高效合成Real Time PCR所用的模板cDNA，特别适合cDNA合成以后的两步法Real Time PCR检测。

本制品合成的cDNA可以用于SYBR Green法和TaqMan探针法的定量PCR分析，可以根据实验目的与我司定量PCR产品中的QuickFire qPCR PreMix（SYBR Green)和QuickFire qPCR PreMix （Probe)等定量试剂配合使用，进行更加快速和高效的基因表达分析。

产品特点：
·便捷：本产品为预混Mix形式，只需加入模板RNA和水便可以进行反应。
·快速：只需42℃，18min即可完成cDNA第一链的合成。
·高效：反转录效率可达90%以上。
·普适：通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。

产品应用：
· RT-PCR
· RT-qPCR
· cDNA文库构建

使用实例：

使用本制品反转录人类细胞系293T的总RNA。以得到的cDNA为模板，分别扩增不同长度目的基因，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，本制品能够高效反转录至少5 kb的片段。RNA使用量为1μg；电泳条件为6 V/cm,20 min。

使用本制品反转录人类细胞系293T的总RNA。按10的倍数稀释得到的cDNA模板，使用染料法试剂对人类GAPDH基因进行qPCR检测。结果显示，本制品反转录能得到高质量的cDNA，适用于染料法qPCR检测目的基因的含量。RNA使用量为1μg，荧光定量所用试剂为SuperReal PreMix Plus（SYBR Green) （WH0103)，使用仪器为ABI 7500 Fast qPCR System。图中分别展示扩增曲线（A)，标准曲线（B)和熔解曲线（C)。

使用本制品反转录人类细胞系293T的总RNA。按10的倍数稀释得到的cDNA模板，使用探针法试剂对人类GAPDH基因进行qPCR检测。结果显示，本制品反转录能得到高质量的cDNA，适用于探针法qPCR检测目的片段的拷贝数。RNA使用量为1μg，荧光定量所用试剂为SuperReal PreMix（Probe)（WH0104)，使用仪器为ABI 7500 Fast qPCR System。图中分别展示扩增曲线（A)和标准曲线（B)。

试剂盒组成：

组分	25次	100次
4× QQ-RT Super Mix	125μl	500μl
RNase-Free ddH2O	1ml	2×1ml

储存条件：-20℃可保存12个月。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．本产品的适宜模板量范围为50ng-2 μg的总RNA，如果总RNA量大于2 μg，请按比例扩大反应体系。
2．在冰上进行操作，防止发生RNA降解。
3．不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5 min后迅速转移到冰上，进行下一步操作。
4．反转录体系可以根据需要相应扩大。

操作步骤：
使用QuickQuant cDNA第一链合成预混Mix合成第一链cDNA，50ng-2μg的总RNA可建立20 μl反应体系。

1．将模板RNA在冰上解冻；4× QQ-RT Super Mix和RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
  以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行反应体系配制时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2．按照下表所示配制反转录反应体系。

成分	使用量
4× QQ-RT Super Mix	5 μl
Total RNA	50ng-2μg
RNase-Free ddH2O	补足到20 μl

3．按照下表所示进行反转录反应。

反应温度	反应时间	说明
42℃	15min	反转录反应
95℃	3min	酶灭活过程

注意：
1．若后续实验为实时荧光定量PCR，逆转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10，例如50 μl的PCR反应体系，逆转录产物的加量应不超过5 μl。
2．将逆转录产物置于冰上，再进行后续PCR反应；如果需要长时间保存，请置于-20℃下保存。

RNA模板质量控制：
逆转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA，因此模板RNA的质量直接影响逆转录结果。

1．模板的完整性：模板RNA的完整性对逆转录非常重要，若RNA模板中含有RNase酶将降解模板RNA，zuì后导致cDNA产物的量减少甚至无cDNA产物。
2．模板的纯度：若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，将影响逆转录酶的活性，zuì终影响逆转录结果。如若含有基因组DNA将影响后续实验的准确性。
3．模板的加样量：以上操作步骤适用于模板RNA量为50ng-2 μg，如果模板RNA的量大于2 μg，请按比例扩大反应体系。

除了一管式反转录试剂,，我公司还供应以下相关产品：



名称：Activin A mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0021
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Activin A mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗*高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯*醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Activin的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。