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- 2025年07月11日
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- 详细信息
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- 技术资料
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35
- 英文名：
Enterohemorrhagic E. coli(EHEC)O104:H4PCR
- 保质期：
详见说明书
- 供应商：
上海抚生
- 保存条件：
低温冷藏
- 规格：
详见说明书
点击了解更多PCR检测试剂盒。
| 产品名称 | 肠出血性大肠杆菌104:4血清型PCR检测试剂盒说明书 |
| 英文名称 | Enterohemorrhagic E. coli(EHEC)O104:H4PCR |
| 编号 | FS-R1426 |
肠出血性大肠杆菌104:4血清型PCR检测试剂盒说明书清理液（A） 毫升
染色液（t B） 微升
稀释液（C） 毫升
溶解液（tD） 毫升
产品说明书 1份
注意事项
1．肠出血性大肠杆菌104:4血清型PCR检测试剂盒说明书基础程序；
2．扩增温度和延伸温度；
3．反应时间；
4．循环次数；
5．PCR 反应液的配制；
6．PCR技术的基本原理；
7．PCR的反应动力学；
8．PCR扩增产物；
9．PCR反应体系与反应条件。
反应五要素
肠出血性大肠杆菌104:4血清型PCR检测试剂盒说明书参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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技术特点：
1肠出血性大肠杆菌104:4血清型PCR检测试剂盒说明书准确可靠，临床双盲对照试验＞1000例，结果与金标准测序法比对，结果一致性大于99%。
2高灵敏：可检测低至10ng的人基因组DNA。
3快速：整个检测流程只需3小时。
4简便：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配置操作简便。
5防污染
6高特异性：双重特异性组成，保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对，才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对，在延伸中产生荧光。
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文献和实验或存放不当：质粒提取试剂盒成分复杂且保存条件不同，有的试剂还容易出现浑浊。在使用之前需要检查试剂是否保存得当，如果出现浑浊，可参考试剂盒说明书，进行 37℃ 温浴至溶液澄清，再冷却至室温使用。 ⑦洗脱液体积不合适：洗脱液使用体积过大会导致提取浓度偏低，过小会导致洗脱不充分，产量过低。建议参考试剂盒说明书来确定洗脱体积，如果洗脱浓度偏低，可以重复洗脱一次； ⑧洗脱液未添加到硅胶膜中心：可能会导致洗脱液覆盖不完全，导致洗脱效率降低。此外洗脱液可以使用碱性洗脱缓冲液或者无核酸酶的水，避免使用 PH＜
。14、28、56、90 d后0．25％ 胰酶消化，PBS洗涤，用含1％ 甲醛的PBS固定细胞后用流式细胞仪(Becton Dickinson FACS calibui)检测荧光细胞数及荧光强度。以未转染质粒DNA 的细胞作为空白对照。 3．逆转录(RT)-PCR检测EGFP cDNA转录：细胞转染后14、28、60 d采用Trizol试剂抽提细胞总RNA。具体操作参照产品说明书。DNase I孵育去除残留的基因组DNA，紫外分光光度计定量后，以GAPDH基因片段作为内参照，RT．PCR检测
没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。 少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中
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