核酸酶P1来源于桔青霉菌，N8630-1VL

“浓度低、拖尾、细胞死”——质粒大提的坑，一次帮你排完

中最容易出问题的环节。原理上，碱裂解法利用质粒DNA（小、环状）与基因组DNA（大、线性）在变性-复性速度上的差异来实现分离——NaOH使DNA变性，中和后质粒快速复性留在上清中，基因组DNA则与蛋白质-SDS复合物缠绕共沉淀，通过离心去除。但操作细节决定了分离效果的好坏。 菌体重悬 加入重悬液（P1）后必须充分涡旋或吹打，确保无任何肉眼可见的菌块。菌块会导致裂解不均，严重影响产量。 控制裂解时间 加入裂解液（P2）后轻柔颠倒混匀，室温静置时间严格控制在 3~5 分钟内（建议 4 分钟）。P2

在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略

)位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。E.coli 的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核苷酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六核苷酸序列（-10区）组成[9,10,11]。 有许多启动子可用于在E.coli中的基因表达，包括来源于革兰氏阳性菌和噬菌体的启动子。理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli 以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便

　原核基因表达调控

…A…… T7 A2 ……TTGACA…… N17……TACGAT… N6…A…… fd Ⅷ ……TTGACA…… N17……TATAAT… N6…G……不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同，启动转录的频率高低不同，即不同的启动子起动基因转录的强弱不同，例如：PL、PR、P�T7属强启动子，而P1ac则是较弱的启动。 (三)操纵子 操纵子(operator)是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响