固定组织RNA提取试剂盒

特别提示：包括固定组织RNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：固定组织RNA提取试剂盒
英文名称：RNAtiqu FFPE RNA Extraction Kit
产品货号：WE0196
产品规格：50次

  本试剂盒适用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中有效纯化总RNA。适合从小于30 mg的石蜡包埋组织或切片中抽提高纯度的总RNA，本试剂盒无需使用酚/*仿抽提和异丙*沉淀，一小时内即可完成多个样品的抽提。本品使用专门优化的裂解液和蛋白酶K，释放福尔马林固定或组织切片样本中的RNA，无需过夜操作；消化后的样品在较高的温度孵育后，去除由福尔马林交联造成的抑制作用，有效释放组织切片中的RNA，而避免危害RNA的完整性；优化的缓冲系统使裂解液中的RNA可特异结合到硅胶吸附膜上，而其他污染物可流过膜；可通过漂洗步骤有效去除，经过洗脱的RNA可直接用于RT-PCR、Real-Time PCR和印迹分析等实验。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer GTL	15ml
Buffer GL	25ml
蛋白酶K	12.5mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
过滤柱FM及收集管	50套
吸附柱RS及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

自备试剂：无水乙醇(新开封或提取RNA专用)、10mM PBS(PH7.4)(固定液中的组织)。

产品特点：
1、安全－无酚*仿等有机物抽提。
2、快速－可在一小时内完成实验。
3、高效－提取RNA得率高、纯度好。
4、可从石蜡包埋或福尔马林固定样品中提取高纯RNA。

实验前准备及重要注意事项：
1、向蛋白酶K 中加入0.625ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M的NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3)配制溶液应使用无RNase的水。
4)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
3、获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的福尔马林中固定，固定时间以14-24小时为宜，时间过长易导致RNA断裂，影响下游实验。
4、确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制蛋白酶K 的作用。
5、第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
6、使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GTL和Buffer GL于56℃水浴重新溶解。

操作步骤：
1、样本处理：
① 石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织。
② 福尔马林等固定液中的样本：取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μl 10mM PBS(PH7.4),涡旋振荡，12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，重复3次，可直接进行第7步操作。
2、将组织块切成5-10μM的薄片。
注意：如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。
3、取约1×1cm2的切片(共约4-5片切片)置于离心管(自备)中，加入1ml二甲*，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
4、12000rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
5、加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
注意：乙醇可以除去样品中残余的二甲*。
6、打开管盖，室温或zuì高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。
7、加入150μl Buffer GTL，重悬沉淀；加入10μl 蛋白酶K ，涡旋震荡混匀。
8、56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：
1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成RNA断裂，产生RNA碎片。
2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到80℃后再把样品置于80℃孵育。
9、加入320μl Buffer GL，涡旋震荡彻底混匀。
10、将步骤9中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的过滤柱中。12000rpm离心1分钟，收集滤液。
11、在步骤10得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
注意：加入无水乙醇后，可能有少量沉淀物析出，但不影响后续操作。
12、将步骤11中所得的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
13、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
14、重复步骤13。
15、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。
16、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50μlRNase-Free Water，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-20℃保存RNA。
注意：
1)RNase-Free Water体积不应小于20μl，体积过小影响回收率。
2)如果要提高RNA的产量，可用20-50μl新的RNase-Free Water重复步骤16。
3)如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤16。

储存条件：室温(15～30℃)。

除了固定组织RNA提取试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：昆虫RNA柱式提取试剂盒
货号：BTN81220
规格：50次
本试剂盒是专门用于从富含多糖、糖蛋白、粘蛋白的动物样品(尤其是昆虫样品)中提取总RNA的试剂。

试剂盒特点：
1. 操作简单快速，处理一个样品只需要约十分钟。
2. RNA纯度高，平均 OD260/280一般都在2.0左右，能够有效去除大多数昆虫中的多糖污染。
3.适用于各种昆虫组织，每100mg组织能提取到20-30μg 总RNA。
4. 得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA合成等实验。
5.一站式，提供RNase-free的样品收集管。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	50ml
溶液B	15ml
溶液C	50ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
RNA洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存(RNA洗脱液zuì好4℃保存)，有效期一年。

使用方法：
1. 将50-300mg昆虫组织放入10-15mL塑料离心管中，加入1mL溶液A，然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎昆虫组织，砚磨完后加入1mL溶液A。
注意：溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
2. 将匀浆物或砚磨物转移至干净的1.5mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。
3.在离心管中加入0.3mL的溶液B和0.2mL自备*仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
4.室温12000 rmp离心3～5分钟，两相间将有约5-10毫米厚的细胞破碎物。
5. 将上清液(约0.6mL)转移到另一干净的1.5mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。zuì好留下100μl上清液不取。
6. 加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。
7. 将一半的溶液转移到离心吸附柱中，12000 rmp室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000 rmp室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 加0.7mL通用洗柱液，室温12000 rmp离心半分钟，弃穿透液。
10. 加0.3mL通用洗柱液，室温12000 rmp离心半分钟，弃穿透液。此步可以省略。
11.室温12000 rmp离心半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用。
12. 将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入50-100μl RNA洗脱液，室温放置1-2分钟。
13. 12000 rmp室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
14. RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。注意：大部分昆虫的28S RNA被切割成两个小的片段，彼此用氢键相连，所以在甲醛变性胶中，没有28S带出现(文献见：Eva C. Winnebeck，Craig D. Millar and Guy R. Warman，Why does insect RNA look degraded? Journal of Insect Science: Vol. 10：1-7)
15. RNA产量产率测定：将5-10μl RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。
16. RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。