APLP1 mRNA原位杂交试剂盒

特别提示：包括APLP1 mRNA原位杂交试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：APLP1 mRNA原位杂交试剂盒
英文名称：APLP1 mRNA in situ hybridization kit
产品货号：ZN0078
产品规格：100T

基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.APLP1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多*甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多*甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多*甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲*50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多*甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二*苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多*甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
APLP1的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

除了APLP1 mRNA原位杂交试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台)
货号：WE0229
规格：24次|96次
  本试剂盒提供了DNA文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液，包含除接头与PCR引物外的所有成分，用于illumina二代测序平台DNA文库构建。和一般建库方法相比，该试剂盒操作简单、方便，极大地缩短了文库构建时间。另外，试剂盒采用高保真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，zuì大程度上保证了文库构建的稳定性。

试剂盒组成：

组份	24次	96次
End Prep Enzyme Mix	48μl	192μl
10x End Repair Reaction Buffer	200μl	800μl
T4 DNA ligase	48μl	192μl
T4 DNA ligase Buffer	400μl	2×800μl
HiFidelity 2×PCRMasterMix	600μl	2×1.2ml

试剂盒特点;
1、末端补平，磷酸化，加A一步完成。
2、不需纯化，直接加接头。
3、超保真扩增，zuì大程度上降低了扩增偏好性。
4、支持多种样本，且所得文库能够用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。

自备仪器、试剂和耗材：
1、磁力架：建议使用DynaMagTM-2(货号： 12321D)。
2、DNA纯化回收试剂盒：建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(货号： WE0205)。
3、样本接头引物试剂盒：建议使用百奥莱博二代测序多样本接头引物试剂盒 I/II(货号：WE0241/WE0240)。
4、无水乙醇，EB(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，去离子水(pH 在7.0-8.0之间)。
5、反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5ml离心管；枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染

实验前准备及重要注意事项：
1、避免试剂的反复冻融，建议您首次使用试剂盒后将剩余试剂分装保存。
2、PCR产物因操作不当极易产生污染，导致实验结果不准确，建议将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离，并使用专门的移液器，定时对各实验区域进行清洁。

DNA建库流程示意图：



操作步骤：

样本要求： 5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB(10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中。DNA纯度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。

DNA末端修复反应：
1、向200μl PCR管中加入以下试剂：

试剂	体积
10×End Repair Reaction Buffer	6.5μl
End Prep Enzyme Mix	2μl
fragmented DNA	X(5ng-1μg)
RNase-free Water	Up to 65μl

2、用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心,使所有组分收集到管底。
3、将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开， 反应程序如下：
15 min @ 12℃
15 min @ 37℃
20 min @ 72℃

Adaptor 连接：
建议使用百奥莱博adaptor进行连接，也可选择使用NEB、illumina公司的adaptor，具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用百奥莱博adaptor进行连接的操作步骤：
1、向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂：

试剂	体积
T4 DNA ligase buffer for illumina	14μl
T4 DNA ligase	2μl
Adaptor	2.5μl

此时管中溶液总体积为83.5μl。
注意：若起始样本量少于100ng，请将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM后使用。
2、用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
3、20℃温浴15分钟。
注意：若此操作使用pcr仪，请将热盖关闭。

DNA片段的选择性回收：
  建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(WE0205)进行DNA片段选择性回收。
注意：DNA片段选择性回收是可选步骤，若起始样本量低于50ng，不建议进行DNA片段选择性回收，直接进行DNA片段的纯化。另外构建不同大小的DNA文库时，DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同，具体磁珠用量可参照附表1(若使用除百奥莱博以外厂家的磁珠，需自行摸索zuì佳磁珠用量)。
  以下操作步骤中，可选择回收DNA片段长度峰值为320bp(插入片段长度200bp)，反应起始体积为100μl。
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、向连接反应液中加入16.5μl去离子水，使adaptor连接反应缓冲液体积至100μl。
注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μl去离子水。
3、将上述adaptor反应缓冲液转移至一新的1.5ml离心管中。
4、加入70μl混合均匀的MCPure，涡旋震荡5秒钟后, 室温静置5分钟。
5、短暂离心，将离心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心地将上清溶液转移至新的1.5ml离心管中,并弃去磁珠。
注意：不要弃除上清。
6、向上清中加入25μl混合均匀的MCPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。
7、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
8、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
9、重复步骤8。
10、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
11、将离心管从磁力架上取下，加入28μl 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)或去离子水(自备)，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
12、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中；
注意：一定不要转移磁珠，微量磁珠污染可影响后续PCR反应的正常进行。

另一种方案： DNA片段的纯化：
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。
4、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下，加入28μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
9、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中。

附表1：不同片段选择回收时磁珠建议用量

DNA文库大小	插入片段	150bp	200bp	250bp	300-400bp	400-500bp	500-700bp
	插入片段+adaptor	270bp	320bp	400bp	400-500bp	500-600bp	600-800bp
磁珠用量	第一次选择	85	70	55	50	45	35
	第二次选择	25	25	20	20	20	15

PCR扩增：
1．在PCR管中加入以下试剂并混匀。

试剂	体积
连接adaptor后的DNA片段	23μl
2×HiFid elity PCR Mix	25μl
Univesial primer	1μl
Index primer	1μl
总体积	50μl

2、PCR反应条件：

步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	30 s
变性	98℃	10 s	6-16个循环
退火	65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
终延伸	72℃	5 min

注意：建议1μg样本起始量时PCR循环数为6个循环，50ng时10个循环，5ng时14-15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。

PCR产物的纯化：
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。
4、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)。小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下，加入30μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
9、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μl，DNA文库在-20℃保存。

文库质量检测

文库浓度：
  为了得到高质量的测序结果，需要对DNA文库进行精确定量，首先推荐使用Real-time PCR方法对DNA文库进行绝对定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法或荧光染料picogreen法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。zuì终可使用以下近似公式换算DNA文库的摩尔浓度。

文库平均总长度	近似转换公式	成簇反应DNA文库浓度
200 bp	1ng/μl=7.5 nM	6-12 pM
300 bp	1ng/μl=5.0 nM	6-12 pM
400 bp	1ng/μl=3.8 nM	6-12 pM
500 bp	1ng/μl=3.0 nM	6-12 pM

文库长度分布
制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库中的片段长度分布范围。


图1：Agilent 2100 Bioanalyzer文库分析结果
L：DNA Ladder；
S：使用200ng人基因组DNA构建文库，磁珠进行选择回收后结果。

文库结构
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
NNNNNN：index, 6bases

储存条件：-20℃