细胞凋亡检测试剂盒IV(FITC+POD)

特别提示：包括细胞凋亡检测试剂盒IV(FITC+POD)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞凋亡检测试剂盒IV(FITC+POD)
产品货号：ZN1528
产品规格：20T

保存条件：-20℃冰冻保存。
保存期：一年
工作原理：
在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA 被切割，出现单链或双链缺口，并产生与 DNA 断点数目相同的3’-OH 末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以将Digoxin标记的dUTP(DIG-dUTP)标记至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 结合在 DNA 断点部位，可以通过生物标记的抗Digoxin抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后，再结合荧光素 FITC或者过氧化物酶 POD 标记的链酶亲和素(SABC-FITC/SABC-POD)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 发射荧光，在荧光显微镜下呈明亮黄绿色。POD的在加入显色底物 DAB 显色后，凋亡的细胞核呈棕黄色。用户根据实验需要，在不同切片上用两套不同显示系统观察。
试剂盒内容：
1．标记缓冲液(Labeling Buffer)1ml
2．末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)20μl
3．DIG-dUTP(×20)20μl
4．封闭液(Blocking Reagent)4ml
5．生物素化抗Digoxin抗体(× 100)20μl
6．SABC-FITC(× 100)20μl
7．SABC-POD(× 100)20μl
8．Proteinase K(×200)50μl
9．抗体稀释液 4ml
10．未染色阳性对照片 2 张。
用户自备试剂：
1．多聚赖氨酸或APES。
2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克 Tris和0.45—0.5ml纯乙酸。)
3．水溶性封片剂。
操作步骤：
1．样品处理
(1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES 进行处理。
(2)细胞涂片和冰冻切片：zuì重要的是及时固定。用 4%多聚*醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室温下固定 30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤 2分钟×2次。
(3)组织：有条件时应及时固定。常规 4%多聚*醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。
2．标本片加 0.01M TBS 1:200 新鲜稀释 Proteinase K 37℃消化 1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化 10—60 秒钟。新鲜石蜡切片消化 5-10分钟。陈旧石蜡切片消化 10-15分钟)。
3．标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片湿润。按每张切片取 TdT和DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。
4．0.01M TBS洗2分钟×3次。
5．加封闭液 50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。
6．用抗体稀释液 1：100 稀释生物素化抗Digoxin抗体：(取 1ml 抗体稀释液加生物素化抗Digoxin抗体10μl)，混匀后 50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。
7．用抗体稀释液 1：100 稀释 SABC-FITC/(SABC-POD)：取 1ml 抗体稀释液加 SABC-FITC/(SABC-POD 10μl，混匀后 50μl/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。
8．加 SABC-FITC的在荧光显微镜下用蓝色光激发观察。
9．加 SABC-POD的，可选用 DAB 显色：取 1ml 蒸馏水，分别加入 DAB 试剂盒中 A，B，C 试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色 10-30分钟左右。水洗。
10．苏木素轻度复染。0.01M TBS洗，蒸馏水洗。水溶性封片剂封片。
结果判定：
荧光显微镜下：细胞核中有黄绿色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
普通显微镜下：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
注意事项：
1.试剂盒严格-20℃存放。
2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心 5分钟，使试剂沉至管底。
3.检测过程中切勿使样品干涸。

除了细胞凋亡检测试剂盒IV(FITC+POD),，我公司还供应以下相关产品：



名称：细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(WST-1法)
货号：YT126
规格：100次|500次
本试剂盒是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan(参考下图)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。



WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高(参考下图)。



本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。

本试剂盒检测非常便捷。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。

酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。WST-1对细胞无明显毒性。加入WST-1显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到zuì佳测定时间。

注意事项：
由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈zuì容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

储存条件：-20℃，有效期一年。

名称：喜树碱溶液(5mM)
货号：SY0482
规格：400μl
喜树碱（Camptothecin，CPT），从Camptotheca acuminata（Camptotheca，喜树）的树皮和树干中分离到的一种*啉类生物碱，呈现出抗白血病和肿瘤特性。喜树碱是一种有效的拓扑异构酶I（Topoisomerase I, Topo I）抑制剂，不可逆结合DNA-Topo I复合物，抑制Topo I切割后DNA的重新结合，并且以共价连接DNA的方式固定化酶。该酶复合物随后发生泛素化并被26S蛋白酶体破坏，zuì终将胞内拓扑异构酶消耗殆尽。低浓度的喜树碱可停滞细胞周期在S期，并以细胞周期依赖或者非依赖的方式诱导大量正常或癌变细胞发生凋亡。

喜树碱常被用来诱导并建立细胞凋亡模型，其在体外按照剂量依赖的表现诱导凋亡发生。本品以溶于DMSO的母液形式提供，浓度为5mM，只需加入细胞培养液稀释到需要的工作浓度即可，操作简单方便。

英文别名：(+)-camptothecin;(S)-camptothecin;21,22-Secocamptothecin-21-oic acid; lactone 20(S)-camptothecin; (S)-(+)-camptothecin; NSC100880;
CAS：7689-03-4
分子式：C20H16N2O4
分子量：348.36
纯度：>98 %
储存条件：-20℃，有效期一年
结构式


名称：活细胞/膜损伤细胞双染试剂盒
货号：HR8290
规格：500T/1000T
正常细胞/膜损伤细胞染色试剂盒是采用Calcein-AM/7-AAD 双染细胞的方法染色活细胞和膜损伤细胞(死细胞)。
Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM 由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein 留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM 是zuì适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。
7-AAD 是一种非渗透性荧光染料，作为核染色染料的7-AAD 不能穿过正常活细胞的细胞膜，但可穿透膜损伤细胞如晚期凋亡细胞或者坏死细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA 上，形成具有高荧光性的加成物，从而产生红色荧光(激发：488，545nm，发射：647 nm)，因此7-AAD仅对膜损伤的死细胞染色。可以用来检测膜损伤的无活性的细胞。
由于Calcein和7-AAD-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和膜损伤细胞。用545 nm 激发，仅可观察到膜损伤细胞。

储存条件：染料-20℃避光保存；避免反复冻融；稀释液2-8℃保存。
有效期：六个月。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制：本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新：我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。需要zuì新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全：使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● zuì好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
仪器
●离心机 ●荧光显微镜/流式细胞仪 ● 移液器 ●冰箱 ●冰盒
耗材
●离心管 ● 吸头
试剂
● PBS、HBSS

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
● 由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
● Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
●试剂A 母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
●染色液A 为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
●试剂量较少，为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。

使用方法：
1．染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用稀释液将染料10倍稀释，再用相应的无血清培养基或其他缓冲液(如HBSS)进行50-100倍稀释，配制成染色工作液。。
【注】：
● 由于不同细胞系的zuì佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和7-AAD的zuì适浓度。梯度筛选的原则为使用zuì低的探针浓度得到zuì好的荧光结果。
● 一般细胞按以上稀释比例1000倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至200-500倍稀释或者延长染色时间。
● Calcein-AM溶液和7-AAD溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，先染色Calcein AM，再染色7-AAD。
2．收集样本细胞，细胞数量在1×106个以内。
3．用PBS 洗涤细胞两次。
【注】：
● 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM 遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用PBS 洗涤数次直到完全洗净。
4．用200μl染色工作液将细胞重悬。
5．4℃避光孵育15-30分钟。
6．用PBS洗涤细胞。
7．用适量PBS重悬细胞。
8．用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。染料-DNA 复合物的zuì大激发490±10nm，zuì大发射波长分别为515nm和647nm。
【注】：在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察。

结果分析：
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，膜损伤细胞为红色。
用545 nm波长激发，能够看到红色的膜损伤细胞/死细胞。