两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)

特别提示：包括两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)
英文名称：SYBR Two-Step qRT-PCR UltraMix
产品货号：JN0052
产品规格： 50次RT+300次qPCR

  本试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用BalbScript All- in-one 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix进行反转录，用BalbScript SYBR qRT-PCR UltraMix进行荧光定量。具有灵敏度高，合成能力强，扩增效率高的优点。
  本制品配有不同浓度的ROX Reference Dye，用于不同仪器校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

操作方法：
一、第一链cDNA合成
融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
1、按顺序加入下面的反应物

加入物	加入量
模板RNA	总RNA(0.1 ng -5μg) poly(A) mRNA(10 pg) 特异性RNA(0.01 pg)
PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix	10μl
RNase Free Water	至20μl

2、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却。
3、轻柔混匀后离心。如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟。
4、70℃加热5min终止反应。
  反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20℃可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。
二、实时定量
合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μl。
·用ROX Reference Dye I校准的Real Time PCR仪有：
Applied Biosystems 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast；Applied Biosystems StepOne/StepOne Plus；其他仪器。
·用ROX Reference Dye II校准的Real Time PCR仪有：
Applied Biosystems 7500/7500 Fast；Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P；其他仪器。
·不需要用ROX Reference Dye校准的Real Time PCR仪有：
Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/ iQ /My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon /Chromo4；Eppendorf MasterCycler realplex/ realplex 2s。Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；R℃he Applied Science LightCycler 480；Thermo Scientific PikoReal Cycler；Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/ Rotor-Gene 6000；其他仪器。

注意事项：
1、用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂中无RNA酶污染。
3、试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。
4、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和*酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。

储存条件：-20℃

除了两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR),，我公司还供应以下相关产品：



名称：dNTP溶液(10mM)
货号：BTN51208B
规格：0.5mL
本产品是dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种核苷酸的混合液，每种核苷酸的浓度为10mM，纯度在98%以上(HPLC检测)，不含DNA内切酶、DNA外切酶、RNA酶和磷酸酶的污染，可以直接用于PCR、RT-PCR、cDNA合成、DNA测序、DNA探针标记等反应。使用浓度根据具体的反应决定，请参考相关手册。



储存条件：低温运输和-20℃保存、有效期一年。

DNA为何使用2"-脱氧核糖和胸腺嘧啶？
 DNA为何不选择现成的光合作用产物核糖和合成RNA的原料尿嘧啶(uracil)分别作为其糖分子和碱基，而去选择需要额外的合成步骤才能得到的2"-脱氧核糖和胸腺嘧啶(thymine)，其原因何在呢？目前的主流观点是：DNA不能选择核糖的原因之一是由于核糖2"位置上的OH基团会使得到的双螺旋骨架结构不均匀、不平行，难以有效地折叠进染色体结构中，而使用2"-脱氧核糖则能得到均匀平行的双螺旋结构；原因之二是核糖2"位置上的OH基团会对邻近的磷酸二酯键进行分子内亲核攻击，降低分子的稳定性，而对遗传物质来说稳定性十分重要，所以DNA选择了失去分子内亲核攻击能力的2"-脱氧核糖。对信使分子而言，稳定性并不重要，所以RNA仍然使用核糖。
 DNA使用胸腺嘧啶的原因是DNA中的胞嘧啶(cytosine)会缓慢水解变成尿嘧啶，如果尿嘧啶也是DNA的正常组成成份，则DNA修复系统就不能区分哪些尿嘧啶是正常的，哪些是需要修复的。使用胸腺嘧啶(比尿嘧啶分子多一个甲基)不但能保持跟尿嘧啶一样的形成碱基对的能力，同时又能跟尿嘧啶区别开来，使DNA分子中出现的任何尿嘧啶都能被尿嘧啶DNA糖苷酶(uracil-DNA glycosylase)发现和修复。

名称：BaHF高保真DNA聚合酶
货号：WE0113
规格：500U|2500U
  本产品是经过特殊处理的热启动高保真聚合酶。该聚合酶具有5"-3"DNA聚合酶活性，5"-3"核酸外切酶活性和3"-5"核酸外切酶活性，在普通PCR条件下，与BaldStar Taq DNA Polymerase相比，具有扩增效率高、错配率低的优良性能。化学修饰使该酶在常温下没有聚合酶活性，有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活须在95℃下孵育10分钟，该条件可以整合入已有的PCR热循环程序。优化的缓冲体系使酶的作用发挥zuì大功效，实现对目的片段的高保真、高特异性、高扩增效率、高灵敏度扩增。使用本制品扩增得到的PCR产物的3"端附有一个“A”碱基，因此可直接用于T/A克隆。本产品应用于常规的PCR、RT-PCR和多重PCR，特别适用于对特异性、保真性和扩增效率均有较高要求的PCR。

产品组成：

组份	500U	2500U
BaHF DNA Polymerase, 5 U/μl	100μl	5×100μl
5×BaldStar PCR Buffer	1.9ml	5×1.9ml

注意：本产品的5×BaldStar PCR Buffer中含有8.5 mM镁离子。

活性定义：
用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；
5、室温存放一个月，无明显活性改变。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
5×BaldStar PCR Buffer	10μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	＜0.5μg	＜0.5μg/50μl
BaHF DNA Polymerase ，5 U/μ l	0.5μl	2.5 U/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 min
变性	94℃	30 s	30-40个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	60 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2)延伸时间应根据所扩增片段大小设定，本产品中所包含的BaHF DNA Polymerase的扩增效率为1-2 kb/min。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。
4)本产品须在预变性95℃，10 min条件下实现酶的活化。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。