产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)

产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)
产气荚膜梭菌能引起人类食物中毒和抗生素相关性腹泻等, 广泛存在于自然界的土壤、水源及人和动物肠道中。目前根据产气荚膜梭菌产生的4 种重要的致病性毒素(α、β、ε、ι毒素)能力, 可将其分为A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι)型, 各型产气荚膜梭菌均含有α-毒素(CPa)基因。LAMP 等温扩增（环介导等温扩增）利用4条模板专一的特异引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温条件下(63℃左右) 30-60分钟完成扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于 PCR 技术，同时还不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，不依赖任何专门的仪器设备。本产品即是针对产气荚膜梭菌 CPa 基因设计的LAMP特异引物组，采用环介导等温扩增法结合荧光染料显色的体外扩增检测技术，适用于溶血性链球菌核酸的快速检测。

产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)产品特点：
1. 高特异性，由于同时使用4-6条特异引物，所以特异性比RT-PCR更高。
2. 高扩增效率，扩增效率可达到10E9-10E10，比PCR灵敏一个数量级，可检测到单拷贝的RNA分子。
3. 65℃左右完成RT和LAMP扩增，不需要贵重的热循环仪。
4. 即开即用，包含了除引物和模板RNA外的所有成份，十分方便。
5. 肉眼检测扩增结果，不需要昂贵的电泳、荧光PCR等仪器。
6. 提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。 

产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)产品组成：

组分	编号	规格
LAMP Mix（2×）	BTN11-180405a	0.5mL
Bst DNA聚合酶(8U/uL)	BTN100209	75μl
对照引物	BTN11-180405b	40μl
对照模板DNA	BTN11-180405c	5μl
25 mM MgCl2	BTN90302	0.2mL
绿如蓝染料
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：模板及引物

产气荚膜梭菌核酸荧光Lamp检测试剂盒(荧光恒温扩增法)使用方法：
1. 在冰上溶解除酶外的各种组份，混匀，稍离心。在反应管中加入以下组份：

成份	样品管	阴性对照
LAMP Mix（2×）	2μl	2μl
FIP引物终浓度	0.4μl	0.4μl
BIP引物终浓度	0.4μl	0.4μl
F3引物终浓度	0.1μl	0.1μl
B3引物终浓度	0.1μl	0.1μl
Loop F引物终浓度（可选项）	0.2 uM	0.2 uM
Loop B引物终浓度（可选项）	0.2 uM	0.2 uM
10×Bst buffer	2.5μl	2.5μl
Betaine（8 mol/L）	0.4 uM	0.4 uM
MgCl2（100 mM）	1.4μl	1.4μl
自备模板DNA	1-100ng	不加
Bst DNA聚合酶(8U/uL)	1μl	1μl
补水到	25μl	25μl

混匀，置于60-65℃保温30-120分钟。注意：如果不使用Loop引物，则最好保温2小时；如果使用Loop引物，则最好保温30分钟。
2. 80℃ 10分钟灭活Bst DNA聚合酶。 
3. 产物置于-20℃备用或立即用于下游检测。扩增产物可选下列方法之一检测：
1) 琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物5μl，1-2%的琼脂糖凝胶电泳，可见LAMP特征性电泳图谱；
2) 向扩增产物中直接加入PCR级绿如蓝染料1.0μl，混匀，稍离心。将反应管置于紫外透射仪或凝胶成像系统中，紫外灯下可见绿色荧光产生；
3) 荧光定量检测。
4. 结果分析：
如果没有扩增，则需要用本试剂提供的阳性对照进行扩增。本试剂盒提供5次阳性对照，反应按下表设置：

成份	阴性对照管	阳性对照管
LAMP Mix（2×）	2μl	2μl
对照引物混合物	4μl	4μl
对照模板DNA	不加	1μl
MgCl2（25 mM）	3μl	3uL
Bst DNA聚合酶(8U/uL)	1.5μl	1.5μl
水	1.5μl	0.5μl

混匀后，置于60℃保温120分钟，其余操作同上。
注意：本对照引物中没有Loop引物，所以最好保温2小时。 
如果阳性对照能够扩增出，则说明试剂盒没有问题，可能是模板或引物的问题。如果阳性对照没有扩增出条带，则是试剂盒的问题，请跟厂家联系。

注意事项：
1. 引物设计对成功扩增十分关键。除用于SNP分型外，尽量以保守区设计引物。
2. 引物至少包括F3/B3和FIP/BIP，加入环状引物F loop/B loop可以使反应速度大大提高。
3. 应优化引物序列、GC含量和尽量避免二级结构。
4. 反应中各个引物的浓度及比例对扩增效果有一定的影响。
5. 建议先将所有引物混合在一起，配制成10?浓度以方便使用。
6. LAMP扩增具有特异性好、灵敏度高、时间快、不需要特殊仪器设备等优点。但太高的灵敏度使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性。因此，必须高度重视扩增产物的污染。常规措施包括严格的实验分区、添加UNG和dUTP（可能导致反应效率下降）、使用荧光定量等不开盖检测方法。实验室一旦遭到污染，所有相关试剂必须全部更换，必要时还得更换实验室。
7. 要确证扩增的为目标基因，可以使用特定的限制性酶切和/或Southern杂交。
8. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品等用途。