常见大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒(EPEC, EHE

常见大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒(EPEC, EHEC, ETEC, EIEC, EAEC五种致泻性大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒)
本试剂盒可用于肠致病性(EPEC)、肠出血性(EHEC)、肠产毒性(ETEC)、肠侵袭性(EIEC)、肠粘附性(EAEC)、大肠埃希氏菌的毒力基因谱及其致病型别的检测。实验结果仅为基础研究提供参考，不作为临床诊断依据。

本试剂盒采用多重PCR技术，适用于五种致泻性大肠埃希氏菌(EPEC、EHEC、ETEC、EIEC、EAEC)的检测。试剂盒的每个反应体系均含有大肠埃希氏菌种属和毒力基因检测的十二对特异性引物，根据PCR扩增产物的条带大小来判断菌株中含有的毒力基因种类并确定其致病型别。

常见大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒(EPEC, EHEC, ETEC, EIEC, EAEC五种致泻性大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒)组成：

英文名称	中文名称	规格	数量
PCR Mix	PCR反应液	195μL/管	5
Taq Ploymerase	Taq酶	10μL/管	3
DNA Extraction	核酸提取试剂	1.5mL/管	2
Negative Control	阴性对照	50μL/管	1
Positive Control	Ec阳性对照	50μL/管	1

储存条件：-20℃，应避免反复冻融，有效期6个月。

常见大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒(EPEC, EHEC, ETEC, EIEC, EAEC五种致泻性大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒)使用方法：

一、样品采集及处理：
?食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 (GB/T 4789.6-2003) 要求进行。
?血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。
?粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
?病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。

二、DNA提取：
?液体培养物：取培养物50μL(培养至一定浊度)或者挑取单克隆菌落加入50μL DNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL做PCR反应。
?固体培养物：可直接挑取单克隆菌落加入到反应体系中，充分混匀。
?血液样本：直接取200μL抗凝血，转至一洁净的1.5mL离心管中，加入1mL双蒸水，剧烈震荡30s，8000rmp离心5min，弃上清，至无明显红色沉淀(若沉淀明显，请再重复上述步骤一次)。加入1mL生理盐水，剧烈震荡15s，13000rmp离心5min，弃上清。加入50μLDNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL做PCR反应。
?粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清。沉淀中加入50μLDNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL做PCR反应。
?其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL做PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

三、常见大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒(EPEC, EHEC, ETEC, EIEC, EAEC五种致泻性大肠埃希氏菌多重凝胶PCR检测试剂盒)检测步骤：
1．反应体系配置
反应体系配制：从试剂盒中取出试剂冰上融化，待试剂完全解冻，充分混匀后瞬时离心。
 注：Taq酶现用现取，尽量避免反复冻融。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应体系的量	N个反应加入的量
Ec PCR反应液	19.5μL	N×19.5μL
Taq酶	0.5 μL	N×0.5μL
总量	20μL	N×20μL

体系分装：将上述反应液混匀后瞬时离心，进行PCR扩增。
2．PCR循环条件设置

程序	循环数	温度	反应时间
1	1	95	4min
2	35	95	40s
		62	1min 10s
		72	1min 40s
3	1	72	5min

四、结果分析：
1．对PCR扩增产物进行电泳分析
若选用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物分离鉴定，推荐使用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶(待胶凉至不烫手时加入染料)，且胶的长度不小于10cm，在 25μL PCR产物中，加入上样缓冲液，混匀后取20-30μL混合液加入至上样孔中；电压值设定为电泳槽正负极距离(cm)与5(V/cm)的乘积；加入5-10μL Maker，同时可用阳性对照的PCR产物作为特异性分子Marker。
2．结果判定
所有大肠埃希氏菌(包括致泻和非致泻性大肠)均有一条uidA的扩增条带。在uidA条带的基础上，若有毒力基因条带的扩增，则为致泻性大肠埃希氏菌。根据DNA Marker和(或)阳性对照判断扩增条带大小，进而确定毒力基因种类，结合毒力基因组合方式判定最终致病型别，具体组合方式见下表。(注：本试剂盒检测的靶序列为保守序列。细菌在靶序列处若发生基因突变，则可能出现假阴性结果。由于毒力基因可在细菌间转移，实际检测中一株菌种可能同时存在含有源自不同型别的致泻性大肠埃希氏菌毒力基因。)

致病型	毒力基因种类 及片段大小	阳性判定结果组合
EPEC	bfpB(900bp) escV(540bp)	uidA(1500bp)+	典型:bfpB(+),escV(+),stx1(-),stx2(-) 不典型:bfpB(-),escV(+),stx1(-),stx2(-)
EHEC	escV(540bp) stx1(240bp) stx2(320bp)	uidA(1500bp)+	escV(+/-),stx1 (+),stx2 (-),bfpB (-) escV(+/-),stx1 (-),stx2 (+),bfpB (-) escV(+/-),stx1 (+),stx2 (+),bfpB (-)
ETEC	elt(650bp) estla(160bp) estlb(170bp)	uidA(1500bp)+	elt(+),estla(-),estlb(-) elt(+),estla(+),estlb(-) elt(+),estla(-),estlb(+) elt(-),estla(-),estlb(+)
EIEC	invE(760bp)	uidA(1500bp)+	invE(+)
EAEC	astA(100bp) aggR(400bp) pic(1100pb)	uidA(1500bp)+	astA, aggR, pic中一条或一条以上阳性

五、检测方法的局限性：
本试剂盒检测的靶序列为致泻性大肠埃希氏菌基因的保守区域，这些基因高度保守稳定。但如果细菌在靶序列处发生基因突变，则可能出现假阴性结果，即发生漏检；同时，样品收集、处理、运送和保存的质量均对检测结果造成影响。鉴于毒力基因可在细菌间转移，实际检测中可存在一株菌种同时含有源自不同型别的致泻性大肠埃希氏菌毒力基因的可能性。

六、注意事项：
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管最好高压灭菌。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。