猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单重凝胶PCR检测试剂盒

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单重凝胶PCR检测试剂盒
一、简介：
本试剂盒用一对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌特异性引物，对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

二、用途：
该试剂盒适用于检测气管分泌物拭子、肺组织等样本中传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)DNA，用于传染性胸膜肺炎放线杆菌的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

三、试剂盒组成：(48T)
组份 数量 规格
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR反应液(APP-PCR MIX) 1管 720μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
阴性对照 (NTC) 1管 50μL/管
阳性对照 (APP-PTC) 1管 50μL/管

四、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单重凝胶PCR检测试剂盒储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

五、PCR仪器适用范围
ABI系列，Roche系列等PCR检测仪等。

六、样品的采集与DNA提取
6.1 样品的采集
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.3 粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
6.1.4 病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。
6.2 DNA提取
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购生产的DNA提取试剂盒(过柱法-凝胶配套)，并按照相应试剂盒说明操作。
6.2.1 培养物：取培养物50μL(培养至一定浊度)或者挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
6.2.2 粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
6.2.3 其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单重凝胶PCR检测试剂盒检测步骤：
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出PCR反应液(APP-PCR MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
PCR反应液 15µL N×15µL
向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(APP-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 PCR反应条件
将各反应管放入PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：
预变性 1循环 94℃ for 2 min
PCR扩增 35循环 94℃ for 30 sec
58℃ for 30 sec
72℃ for 30 sec

八、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌单重凝胶PCR检测试剂盒结果分析：
（1） 称取1.5g琼脂糖放于250mL锥形瓶中，加入100mL 1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热溶解，稍冷后加入10μL染色液混匀，倒入插有梳子的制胶板中。
（2） 待胶凝固后，取10μL Maker(推荐使用DL500 Maker)点样于左侧凝胶孔中，取10μL PCR产物依次点样于凝胶孔中，电压值设定为电泳槽正负极距离(cm)与5(V/cm)的乘积。待溴酚兰指示剂电泳至凝胶中部时停止电泳并使用凝胶成像仪或紫外透照台观察结果。


九、结果分析：
（1） 阴性对照(NTC)：无任何的条带(引物带除外)。 
（2） 阳性对照(APP-PTC)：在80bp处有条带。
（3） 被检样品：在80bp处有条带为阳性样品，否则为阴性样品。
（4） 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。