Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

特别提示：包括Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒
产品货号：HR8285
产品规格：50T/100T

产品背景：
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。
AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS 高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
检测原理：
在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ能与PS 高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。用标记了APC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合Annexin V-APC。
Annexin V-APC 通常与细胞膜非渗透性核酸荧光染料联合使用以检测凋亡细胞。常用的染料是7-AAD。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，核酸染料7-AAD 不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，7-AAD 能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。
7-AAD/Annexin V-APC试剂盒将Annexin Ⅴ与7-AAD匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与Annexin V-APC和7-AAD 结合显色，而7-AAD 则被排除在活细胞(APC阴性)和早期凋亡细胞(APC阳性)之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被APC和7-AAD 结合染色呈现双阳性。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(APC-/7AAD-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(APC+ /7AAD + )；而右下象限为凋亡细胞，显现(APC+/7AAD -)。
Annexin V-APC 细胞凋亡检测试剂盒可以方便快捷的检测凋亡细胞，使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。

储存条件：染色液2-8℃避光保存；结合液2-8℃保存；长期不用-20℃保存。
Annexin V-APC染色液避免反复冻融，冻融2次以上可能会失效。长期保存分装后-20℃保存。
有效期：一年。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制：本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新：我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全：使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。

产品特点：
● 方便：可用流式细胞仪；
●快速：1小时内即可完成实验；
● 准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。
检测方法：
流式细胞仪。
样本类型：
● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
仪器
● 流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦 ●离心机 ● 移液器 ●冰箱 ●冰盒
耗材
●离心管 ● 吸头
试剂
D-● PBS(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液)或者HBSS

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。
● Annexin V-APC和7-AAD 是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。
● 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。
● 使用Annexin V-APC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。
● 如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V 结合。
● 流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1×105。
● 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS 洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-APC，最终导致染色失败。
● 贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。中晚期凋亡细胞失去贴壁能力而漂浮于培养基，此部分细胞对结果有显著影响，不可随意丢弃，需离心后收集与贴壁细胞一起检测，才能全面的反映出细胞凋亡的整体情况；
●对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，7-AAD 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-APC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA 影响Annexin V与PS的结合。
● 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS 翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。
●在进行流式细胞仪检测之前，事先进行显微镜观察有好处。
●有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度很低，难以染色，此时不适合用Annexin V 方法检测凋亡。
样品染色：
1．离心收集悬浮细胞。离心机300-500g力，2-8℃，离心时间5分钟，弃培养基。
【注】：
●对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。
● 贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防损伤细胞膜，引起假阳性。
●检测贴壁细胞时，胰酶消化前，去掉的上清也要保留，因为可能存在一些掉下来的凋亡细胞，在胰酶消化后，再将这些上清加回去，一起离心后收集检测，结果更加准确。
●对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
●离心转速根据平时该细胞实验时的转速即可。
●离心后小心吸除上清，可以残留约50μl 左右的液体，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
2．用冷PBS 洗涤细胞两次。(300g-400g，2-8℃，离心时间5分钟收集细胞)。
3．用400μl 1× Annexin V 结合液悬浮细胞，浓度大约为1-5×106cells/ml。
4．取100μl 细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-APC染色液，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育5-10分钟。
5．加入5-10μl 7-AAD染色液后轻轻混匀于2-8℃ 避光条件下孵育1-3分钟。
6．加入400μl PBS，轻轻混匀。
7．立即用流式细胞仪检测。
【注】：
●染色完成后要尽快上机检测，因为细胞在Annexin V 结合缓冲液中存活时间不会太长。
流式细胞仪分析：
经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。
按照常规的流式凋亡检测的操作即可。
Annexin V-APC的荧光最大激发波长652nm，最大发射波长670nm；7-AAD荧光最大激发波长550nm，最大发射波长在647nm。
上机检测前，须用待测细胞制备质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：
(I)未转染GFP等标记的细胞
① 空白管：阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，7AAD。用于调节电压。
② 单染管：有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。
③ 单染管：有明显凋亡的细胞，只加7-AAD染色。用于调节补偿
④检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/APC，7AAD。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
(II)转染GFP细胞
① 未转染空白管：未转染细胞，阴性对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，7AAD。用于调节电压。
② 转染GFP 空白管：转染GFP的对照组细胞，没有染色的细胞。不加Annexin V/APC，7AAD。用于调补偿。
③ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加Annexin V/APC染色。用于调节补偿。
④ 未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加7-AAD染色。用于调节补偿。
⑤检测管：待测的处理细胞，加Annexin V/APC，7AAD。用空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
【注】：具体流式设置按常规方法即可。请参照流式细胞仪说明书或咨询仪器技术支持。
常见问题分析：
实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。
● 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
● 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA的消化会影响染色，建议使用无EDTA的胰酶，或者消化后用PBS 洗涤干净。
● 细胞离心用冷PBS 洗涤后，应尽量吸干残余液体，残余过多的PBS中含有磷酸根，会形成磷酸钙沉淀，影响Annexin V的染色。
● Annexin V 结合液瓶盖要盖紧密封，长时间暴露于空气后，空气中的CO2进入后形成CaCO3会产生沉淀，从而减少游离的Ca2+，导致实验的结果不佳。
● 污染其他的缓冲液。如吸取PBS 后不更换Tip头会导致游离的Ca2+的减少，从而导致实验的结果不佳。
●阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并检测，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。
实验过程中阳性率偏高。
● 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/7-AAD+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3次
以后才能进行实验。
● 细胞操作不当。贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏，使得假阳性偏高。细胞洗涤、重悬等过程过于剧烈导致细胞膜损伤。Annexin V-APC会进入损伤的细胞膜，在细胞膜内部染色。
● 凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

除了Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：Ad-mCherry-GFP-LC3B
货号：YT160
规格：1ml|10×1ml
本品是一种可以表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染细胞或组织后进行细胞自噬的检测。

LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。LC3最初被分析鉴定为microtubule-associated protein 1 light chain 3。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亚家族，其中对于LC3B的研究最为广泛。到目前为止，LC3B被认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有125个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22个氨基酸蛋白，从而暴露出C端的甘氨酸，人们把它命名为胞质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中，其C端暴露的甘氨酸经过一个类似泛素化的过程，以ATG7为E1样激活酶， 以ATG3为E2样连接酶，以Atg12-Atg5-Atg16复合物为E3样连接酶，在C端甘氨酸上共价连接上磷脂酰*醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)而成为LC3B-PE即LC3B II。与胞质定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬体的内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后，自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬体内膜上的LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解。尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其极强的疏水性，在SDS-PAGE电泳时，LC3B II比LC3B I迁移得更快，其表观分子量分别为14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染细胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下GFP-LC3B以弥散的形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以斑点的形式表现出来。

自噬是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关，在饥饿等不利的环境条件下， 细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。

Ad-mCherry-GFP-LC3B是百奥莱博的重组腺病毒，感染后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。

自噬小体在与溶酶体融合过程中，溶酶体内的酸性环境会导致GFP荧光淬灭，这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难度。mCherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的单体红色荧光蛋白，当其与GFP进行LC3B的共同标记时，在GFP被溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的mCherry因为其卓越的稳定性而被保留。因此，通过融合表达mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追踪自噬过程。在用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染细胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下mCherry-GFP-LC3B以弥散的黄色荧光(mCherry和GFP的综合效果)形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下mCherry-GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来(LC3B dot or punctae)；当自噬体与溶酶体融合后，因GFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。

腺病毒感染细胞后为瞬时表达，通常不会与基因组DNA重组，不能用于筛选稳定细胞株。本产品感染体内外细胞后，有效表达时间通常不少于7天，不同细胞和组织的有效表达时间有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表达很可能会大大减弱。

百奥莱博的Ad-mCherry-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重组腺病毒载体系统，感染普通的细胞后不能进行扩增和重组，从而可以有效降低本产品在活体生物中的风险。

本产品可以在表达E1的HEK293A、HEK293等适当细胞中扩增。

本产品的滴度≥1×108 pfu/ml，使用时可以按照108pfu/ml进行计算。如果按照20 MOI感染6孔板的细胞，每孔50万细胞计算，共可以感染10个孔；如果按照20 MOI感染24孔板的细胞，每孔10万细胞计算，共可以感染50个孔。如果MOI值提高，则相应可以感染的孔数会减少；如果MOI值降低，则相应可以感染的孔数会增加。

注意事项：
1. 反复冻融会降低病毒滴度，如有必要请在收到本产品后分装保存。病毒融解后，如果在一周内使用，可以放置于4℃。如果-80℃保存时间超过一年，可能会导致滴度下降，此时建议重新测定病毒滴度。
2. 腺病毒感染需要细胞表面的CAR受体，请确认拟使用的细胞或组织可以被腺病毒感染。
3. 本产品使用前请仔细阅读附录1《腺病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 1 (BSL-1)，没有确凿证据显示会导致健康成人产生疾病，可以按照常规的微生物实验操作要求进行操作。

储存条件：-20℃，有效期1～2个月。