高保真DNA聚合酶

特别提示：包括高保真DNA聚合酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高保真DNA聚合酶
英文名称：Pfu DNA Polymerase

产品货号：高保真DNA聚合酶
产品规格：100U

Pfu DNA Polymerase 是基于Pfu DNA Polymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/53，是Pfu酶的1/6；

与上一代Pfu DNA Polymerase相比，Pfu中添加了独特的延伸因子、特异性促进因子以及平台期解抑制因子，使其长片段扩增能力、扩增特异性性以及扩增产量方面得到了大幅度提升：1）使用λDNA、质粒等简单模板，Pfu 可以有效扩增长达40 kb的片段；2）使用基因组DNA等复杂模板，Pfu可以有效扩增长达20 kb的片段；3）使用cDNA模板，Pfu可以有效扩增长达10 kb的片段。此外，Pfu对PCR抑制剂具有良好的抵抗能力，可用于细菌、真菌、植物组织、动物组织或全血样品的直接PCR。II Pfu中添加了在常温下能够抑制其5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。

该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，扩增产物为平端。

产品组份：
Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)：100 μl
2×PCR buffer：1.25 ml×2
dNTP Mix(10 mM each)：100 μl
10×Loading buffer：1.25ml

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。

质量控制

核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

1 推荐反应体系及反应程序

1.1 反应体系配制：
a. 所Pfu DNA Polymerase 是基于Pfu DNA Polymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/53，是Pfu酶的1/6；

与上一代Pfu DNA Polymerase相比，Pfu中添加了独特的延伸因子、特异性促进因子以及平台期解抑制因子，使其长片段扩增能力、扩增特异性性以及扩增产量方面得到了大幅度提升：1）使用λDNA、质粒等简单模板，Pfu 可以有效扩增长达40 kb的片段；2）使用基因组DNA等复杂模板，Pfu可以有效扩增长达20 kb的片段；3）使用cDNA模板，Pfu可以有效扩增长达10 kb的片段。此外，Pfu对PCR抑制剂具有良好的抵抗能力，可用于细菌、真菌、植物组织、动物组织或全血样品的直接PCR。II Pfu中添加了在常温下能够抑制其5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动PCR。

该酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，扩增产物为平端。

产品组份：
Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)：100 μl
PCR buffer：1.25 ml×2
dNTP Mix(10 mM each)：100 μl
10×Loading buffer：1.25ml

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。

质量控制

核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

1 推荐反应体系及反应程序

1.1 反应体系配制：
a. 所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分摇匀。为了防止II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶最后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。、

ddH2O	to 50 μl
2×PCR buffer a	25 μl
dNTP Mix(10 mM each)b	1 μl
模板DNAc	optional
引物1(10 μM)	2 μl
引物2(10 μM)	2 μl
Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)d	1 μl

【注】：a. 2×II PCR buffer中已含有Mg2+，终浓度为2mM。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 不同模板最佳反应浓度有所不同，下表为50 μl反应体系推荐模板使用量：

基因组DNA	50 ng～400 ng
质粒或病毒DNA	10 pg～30 ng
cDNA	1～5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)

d. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将酶的使用量在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。II Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性，因此，如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。
1.2 一般PCR反应条件设置：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性a	95℃	30 sec～3 min	1
变性	95℃	15 sec	25～35循环
退火b	56℃～72℃	15 sec
延伸c	72℃	30～60sec/kb
彻底延伸	72℃	5 min	1

【注】：a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃，时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组/cDNA为3 min；
b.一般来说，退火温度设置为引物Tm值。如引物Tm值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤(两步法PCR)。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找最适引物模板结合温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性。如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度，每次+3℃。

c.延长延伸时间有助于提高扩增产量。
1.3 长片段PCR 扩增：
*使用高质量的模板，提高模板使用量；
*使用长引物。
*当推荐程序无法进行扩增时，建议尝试下述Touch Down两步法PC
*Touch Down两步法推荐反应条件设置：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	3 min	1
变性	95℃	15 sec	5
延伸	74℃	60 sec/kb
变性	95℃	15 sec	5
延伸	72℃	60 sec/kb
变性	95℃	15 sec	5
延伸	70℃	60 sec/kb
变性	95℃	15 sec	5
延伸	68℃	60 sec/kb
彻底延伸	68℃	5 min	1

2. 复杂样品的扩增
Pfu具有卓越的长片段扩增能力、扩增特异性以及扩增产量，对许多PCR抑制剂具有良好的抵抗能力，可用于细菌、真菌、植物组织、动物组织或全血样品的直接PCR。推荐扩增的样品类型：

样品类型	扩增方式	推荐操作方式（50µl体系）
全血	直接扩增	吸取1-5µl作为扩增模板
滤纸干血渍	直接扩增	剪取1-2mm2滤纸作为扩增模板
培养细胞	直接扩增	取少量细胞作为扩增模板
酵母	直接扩增	挑取单克隆或1µl菌液作为模板
细菌	直接扩增	挑取单克隆或1µl菌液作为模板
霉菌	直接扩增	挑取少量作为扩增模板
精液	直接扩增	吸取少量作为扩增模板
浮游生物	直接扩增	挑取少量作为扩增模板
植物组织	直接扩增	剪取1-2 mm2 组织作为扩增模板
小鼠尾巴	裂解后吸取裂解液扩增	吸取1-5 μl 裂解液作为扩增模板*
食品	裂解后吸取裂解液扩增	吸取1-5 μl 裂解液作为扩增模板*

*样品裂解液制备过程：

**Lysis Buffer：20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% SDS，pH 8.0。(需自备)

引物设计注意事项
1）引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；
2）引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；
3）引物3’端尽量避免发夹结构出现；
4）引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5）引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6）引物的GC含量控制在40%-60%之间；
7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。

除了高保真DNA聚合酶,，我公司还供应以下相关产品：



名称：6nt随机引物(0.5 ug/uL)
货号：BTN100409
规格：5μg
本产品为长度为6nt的随机引物，序列为5´-(NNNNNN)-3´，主要用于以任何RNA为模板合成cDNA，也可以用于DNA探针的随机引物标计。

储存条件：低温运输和-20℃保存，有效期一年。

疑难解答：
Q：在合成cDNA时，使用Oligo dT12-18和用随机引物有何区别？
A：只有当以带polyA尾巴的RNA作为模板才能使用Oligo dT作为引物，而任何RNA模板都可以使用随机引物。使用后者的序列覆盖率比使用Oligo dT更高。

名称：SP6体外转录试剂盒
货号：BTN91107
规格：50次
本试剂盒是基于SP6 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有SP6启动子的模版DNA，以NTP为底物，从SP6启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需提供含SP6启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模版可以合成2-6μg RNA。
 得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 kb片段)	20μL(10 ng/μL)
SP6 RNA聚合酶混合液	50μl
RNase-free水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有SP6启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将SP6启动子序列(5′ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3′)加上，转录其实是从3端G AGN G中的第一个G开始。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有SP6启动子的载体，并且克隆位点必须位于SP6启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3′突出。如果是3′突出(如选择了Pst I来线性化质粒)，则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板	xμL	总量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建议用50 ng左右；如果模板是质粒DNA，建议用1μg左右；如果用本产品提供的阳性对照，建议用4μL)
SP6转录预配液(2×)	10μl	本成分还含其他促进剂，所以是混合物
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要订购NTP分开的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活SP6 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1.在体外转录体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL。
4. 用等体积(100μL)的Tris饱和酚-氯*抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903；用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

疑难解答：
1. 没有RNA产物。最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2. RNA产量低。最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3. RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有SP6 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6启动子)。
4. RNA长度比预计的长。SP6 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5. 5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则SP6 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。
6. 如何得到带帽RNA？需加入带帽NTP类似物即可，本公司提供5种供选择。