第一链cDNA合成试剂盒(预混试剂)

特别提示：包括第一链cDNA合成试剂盒(预混试剂)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：第一链cDNA合成试剂盒(预混试剂)
英文名称：PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix
产品货号：JN0004
产品规格：50次|100次

  本试剂盒是以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本产品含有反转录反应所需的全部试剂（BalbScript Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，Oligo(dT)18，Random N6，dNTPs），浓度为2×。反应时只需要加入RNA模板和水即可，操作简单，降低操作过程中的污染。合成的第一链cDNA能直接用做PCR或荧光定量PCR的模板，以及第二链cDNA合成或线性RNA扩增的模板，也可用于放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验。

试剂盒组成：

组份	JN0004-50次
2×BalbScript PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix	500μl
RNase Free Water	1ml

注意事项：
1、用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂中无RNA酶污染。
3、试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。
4、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和*酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。

实验步骤：

第一链cDNA合成:
1、融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
2、按顺序加入下面的反应物

模板RNA	总RNA(0.1 ng -5μg) poly(A) mRNA(10 pg) 特异性RNA(0.01 pg)
2×BalbScript PreMix UltraMix	10μl
RNase Free Water	至20μl

3、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65℃孵育5分钟，冰上冷却后再加入其它组分。
4、轻柔混匀后离心，于42℃条件下孵育60分钟。 如果RNA模板中不含poly A结构，可先在25℃条件下孵育5分钟，随后转到42℃条件下孵育60分钟。
5、70℃加热5min终止反应。
反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20℃可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。

第一链cDNA的PCR扩增:
合成的第一链cDNA可直接用于PCR或qPCR。第一链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，第一链cDNA反应液加入2μl。

储存条件：-20℃

除了第一链cDNA合成试剂盒(预混试剂),，我公司还供应以下相关产品：



名称：一步式RT-PCR Mix
货号：BTN130609
规格：1mL
本产品是基于Tth DNA聚合酶的单酶一管式RT-PCR试剂盒。Tth DNA聚合酶通过其逆转录酶活性合成cDNA，再通过其DNA聚合酶活性进行PCR扩增。它跟常规MMLV和AMV的最大区别是逆转录过程可以在高温进行，能有效打开RNA的二级结构，其示意图如下：

同时操作简单一步完成，其操作流程图如下：


产品特点：
1.中途添加试剂，省去反复打开和关闭反应管盖的麻烦，便于同时处理多个检测样品。
2.样品之间的交叉感染和纵向感染的危险性比较低，可以避免假阳性。
3. 改良了酶的品质，实现了优良的检测敏感度。
4. 即开即用，非常方便。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

名称：10mM dNTP溶液
货号：RFT162
规格：0.5ml|5×0.5ml
本品为dATP、dGTP、dCTP、dTTP的等摩尔(10mM)混合物。dNTP纯度均达到99％以上，不含DNase和RNase，适合多种聚合酶的扩增反应。在PCR反应中，10mM dNTP是50μl反应体系用1μl(终浓度为各200μM)。

储存条件：-20℃。

名称：改进型DNA聚合酶
货号：SY0027
规格：250U
Taq Plus DNA Polymerase是Taq DNA Polymerase与一种含有3’ →5’外切酶活性 (校对活性)的蛋白组成的混合酶。其保真性是Taq DNA Polymerase的5倍，且具有更强的扩增性能。一般情况下，使用Taq Plus DNA Polymerase可以得到更高的扩增产量。有些Taq DNA Polymerase不能扩增的片段，Taq Plus DNA Polymerase可以正常扩增。PCR产物的3’端带A，可克隆至T载体。产品中提供的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。


产品组分：
10×Taq Plus Buffer (with 15 mM MgCl2)：5×1mL
25 mM MgCl2：1 mL
dNTP Mix (10 mM each)：200 μl
Taq Plus DNA Polymerase (5 U/μl)：50 μl
5×PCR Enhancer：500 μl
10×Loading buffer：1.25 ml

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃ 30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
核酸外切酶残留检测：10 U的本酶和0.6 μg λ-Hind III在74℃下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：10 U的本酶和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74℃下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA残留检测：50 μl体系中，加入2 U本酶，以ddH2O为模板，扩增E. coli 16 s rDNA基因。35个循环后进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测：50 μl PCR体系中加入1.25 U本酶，以20 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin gene。30个循环后将1/10PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的1 kb条带。


名称：超敏快速基因组PCR扩增检测试剂盒
货号：JN0044
规格：20μl×500次
  本试剂盒专门为基因组及微量DNA PCR扩增检测设计优化，可从少量基因组模板中高效扩增出0.2kb～4kb的目的条带，其灵敏度为普通PCR反应的100～10,000倍。适用于基因组PCR扩增、微量模板、复杂模板等的扩增和大规模基因检测。
针对普通Genotyping PCR循环数目多（40次循环），反应时间较长缺陷，超敏基因组PCR扩增检测试剂盒（快速型）采用Fast Taq DNA 聚合酶，该酶是利用分子进化技术在普通Taq酶基础上改造、制备的新 型Fast Taq DNA聚合酶，其扩增速度大幅提高，至少为普通Taq酶的4 倍，因此大大缩短了基因组PCR扩增检测所需的时间。
  本试剂盒包括2×反应缓冲体系和酶2个组分，2×Reaction Mix包含了genotyping PCR所需的全部试剂、dNTP及PCR增强剂。本产品使用方便快捷，使用时只需在2×Reaction Mix加入引物、模板及酶并加入去离子水稀释至1×即可进行反应。2×Reaction Mix提供普通型/快速上样型两种形式供您选择，经测试，染料的加入不影响扩增性能。2×Reaction Mix中预混蓝色染料的，在配制反应体系时，可很方便地检测各组分混匀情况，在PCR反应完成后可直接电泳，节省时间。
  本试剂盒不同批次之间误差很小，特别适合大规模基因检测和微量DNA的 检测。复杂模板（如含二级结构，GC rich，和重复序列等）的扩增：（如构建基因图谱、测序及分子遗传学研究等）。PCR产物如需克隆，纯化后可直接进行T/A载体克隆。
  本试剂盒适用于从复杂背景中扩增微量模板DNA。由于Genotyping PCR的突变率 高于普通PCR反应，故其产物不推荐用于需高保真的基因克隆。 Genotyping PCR所用引物需精心设计，否则会扩增出较多杂带，（参见PCR引物设计的黄金法则）。

超敏基因组PCR扩增检测反应体系：

组分	体积
2×Reaction Mix*	10μl
上游引物	0.05uM（终浓度）
下游引物	0.05uM（终浓度）
dNTP(各10mM)	1.0μl
模板	1-100ng基因组DNA
FastTaq酶（5U/μl）	0.25μl(1.25U)
ddH2O	至20μl
*反应体系可成比例调整至50μl等体积

超敏基因组PCR扩增检测PCR程序：

当扩增片段<3K：
93℃	1分钟30秒
30次循环	93℃，30秒 57℃，30秒（57℃适用于大多数反应，亦可在55-60℃调整） 65℃，按产物长度15秒/1KB计算
4℃	保温